枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件优化

[目的]优化枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件,提高枯草芽孢杆菌ATCC21332脂肽产量。[方法]利用较低成本的底物对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行发酵优化。[结果]枯草芽孢杆菌在葡萄糖浓度9 g/L、豆粕浓度40 g/L、接种量5%、装液量120 mL(500 mL容量瓶)、温度30°C、转速150 r/min、发酵时间120 h时,脂肽产量最高,为4 885.1 mg/L,比添加活性炭载体的最高产量3 600.0 mg/L增加了35.70%。通过测定发酵过程中不同时间段发酵液中氨基酸含量,发现在81 h时谷氨酸含量急剧增大,添加谷氨酸可使脂肽产量达954.0 mg/L,相比不添加谷氨酸的培养基可使脂肽产量增加近6倍。[结论]该研究为工业化生产提供新思路。     

枯草芽胞杆菌SYL-6脂肽类抗生素发酵条件优化研究

以枯草芽孢杆菌SYL-6为出发菌株,研究了发酵过程中不同培养条件对该菌株产生脂肽类抗生素的影响。结果表明:最有利于脂肽类抗生素产生的发酵条件是发酵时间72h、发酵培养温度31℃、初始pH值7.0、摇瓶装液量120mL/250mL时。     

解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^TM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^-1;70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^-1;100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^-1。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13-C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z= 1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9 Da,是C15-C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13-C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·mL^-1 bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·mL^-1surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·mL^-1,发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。     

枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定

【目的】对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株BAB-1产生的脂肽类物质和挥发性物质进行分离鉴定和抑菌活性研究。【方法】采用HPLC和MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分离纯化和鉴定;采用GC-MS对挥发性物质进行鉴定。【结果】HPLC分析表明,菌株BAB-1产生的脂肽类物质由LP-1、LP-2、LP-3三类组分组成,其中LP-2起主要抑菌作用。MALDI-TOF-MS质谱分析表明,LP-1为surfactin(C13—C15),LP-2为fengycin A(C14—C15)和fengycin B(C14—C18),LP-3成分未能确定。GC-MS结果表明,菌株BAB-1产生的挥发性物质由多种成分组成,主要为醇类、酮类、酸类、胺类和烷烃类等。【结论】枯草芽孢杆菌菌株BAB-1能够产生脂肽类物质和挥发性物质,并且这两类物质都具有较强的抑菌活性。     

芽孢杆菌抗菌肽调控基因的PCR检测及其抑菌活性

为了快速筛选具有拮抗芽孢杆菌菌株,试验以20株拮抗芽孢杆菌为研究对象,采用PCR对4类芽孢杆菌抗菌脂肽合成酶基因进行检测,并通过不同基因型菌株的抑菌活性测定,评价芽孢杆菌抗菌脂肽的活性。结果表明,Surfactin及Bacilysin这2类合成酶调控基因在20株供试菌株中的检测率均为100%;仅TC-4菌株未检测到Fengycin合成酶调控基因;PG-1、LJ-23、HS-11、LB-2菌株未检测到Iturin合成酶调控基因;LJ-23、LB-2菌株未检测到Bacillomycin D合成酶调控基因;LB-2菌株未检测到Mycosubtilin合成酶调控基因。NTSYS聚类分析结果表明,在0.71分类水平上,20个菌株被划分为3类,其中,Ⅰ类菌株ZSH-2对立枯丝核菌的抑菌率为84.27%,Ⅱ类菌株TC-4对立枯丝核菌的抑菌率为53.42%,Ⅲ类菌株LJ-23对立枯丝核菌的抑菌率仅为18.03%。含有ituB、fenB、bmyB调控基因的菌株抑菌活性较高,可作为筛选高效拮抗芽孢杆菌的条件。     

枯草芽孢杆菌B-FS01鞭毛蛋白FCD基因克隆与拮抗活性

以从油菜菌核病菌感染的油菜茎秆上分离得到的广谱性拮抗菌枯草芽孢杆菌为研究对象,克隆了该菌B-FS01鞭毛蛋白FCD基因片段,其序列长为952 bp (GenBank登录号为EF362756).根据FCD序列同源性分析, B-FS01属于以DB9011菌株为代表的亚组,而该亚组菌株普遍具有抗真菌活性.平板抑菌活性试验表明, B-FS01对小麦赤霉病菌具有较好的拮抗活性,高分辨率质谱分析发现其可能产生一些脂肽类抗菌物质.     

一株植物乳杆菌对脂环酸芽孢杆菌的抑菌活性

【目的】筛选具有抑制脂环酸芽孢杆菌活性的乳酸菌,并对其抑菌活性进行研究,为延长果汁的保质期和提高产品的安全性提供理论基础。【方法】用琼脂扩散法,从50株分离自泡菜的乳酸菌中筛选具有抑制脂环酸芽孢杆菌活性的菌株,研究所获菌株发酵上清液(Cell-free supernatant,CFS)经不同pH(3,4,5,6,7)、温度(40,60,80,100,121℃)和酶(过氧化氢酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶)处理后抑菌活性的变化;通过气相色谱-质谱分析乳酸菌代谢物中的组成成分;利用扫描电镜观察CFS处理后脂环酸芽孢杆菌的形态变化;将乳酸菌应用于苹果汁的发酵,并测定发酵过程中乳酸菌和脂环酸芽孢杆菌生长及6种有机酸含量的变化情况。【结果】筛选得到1株具有较好抑菌活性的植物乳杆菌(L10),其代谢物抑菌活性呈pH依赖性,具有温度和过氧化氢酶稳定性,但蛋白酶水解会降低其抑菌活性。植物乳杆菌L10代谢物中的成分主要是有机酸,并且含有环(亮氨酸-脯氨酸)和环(甘氨酸-脯氨酸)两种环二肽。CFS通过对脂环酸芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜造成严重损害,导致细胞破裂,达到杀菌的目的。植物乳杆菌L10能够抑制苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的生长,并且发酵后主要有机酸的含量发生显著变化(P0.05)。【结论】植物乳杆菌L10可以产生有机酸、细菌素等抑菌物质来杀灭脂环酸芽孢杆菌,可以应用于果汁的发酵及生物保存。     

产Iturins族脂肽生防芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定

为获得能够产Iturins类脂肽的芽孢杆菌以应用于植物的生物防治中,以果蔬体内、根际土壤等多生境中分离的118株细菌为出发菌株,采用平板对峙法、管碟法对其进行了初筛和复筛。结果表明:其中3株菌株对立枯丝核菌、瓜果腐霉和尖孢镰刀菌显示出强烈的抑制作用;通过薄层层析等方法对产Iturins脂肽菌株进行初步分析,最终确定K103为目标菌株。通过形态学鉴定、生理生化试验及16SrDNA的分子生物学等方法,对产抗菌脂肽的K103菌株进行分类学鉴定,最终确定菌株K103为解淀粉芽孢杆菌,并将其命名为解淀粉芽孢杆菌K103(Bacillus amyloliquefaciens K103)。     

枯草芽孢杆菌SYL-6脂肽类化合物的分离与稳定性分析

通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从枯草芽孢杆菌SYL-6菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物进行抑菌试验,结果表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该物质对热稳定,能耐受较广的p H值范围,对紫外线有较好的稳定性。     

培养基对解淀粉芽孢杆菌ES-2菌株产抗菌脂肽的影响

【目的】研究培养基对解淀粉芽孢杆菌ES-2菌株产生抗菌脂肽的影响,为选择合适的产抗菌脂肽的培养基提供指导。【方法】通过HPLC技术对培养基中的碳、氮源对ES-2菌株抗菌脂肽组分的影响进行试验。【结果】 改进的Landy培养基抗菌脂肽产量较高;葡萄糖是ES-2菌株产生脂肽的良好碳源,特别是对surfactin的产生有明显的促进作用;蔗糖和乳糖也是产生fengycin的良好碳源;L-谷氨酸和L-天门冬酰胺是抗菌脂肽产生的良好氮源;而不同的氨基酸 组合并不有利于抗菌脂肽的产生;实验结果还显示,6种脂肪酸对抗菌脂肽的产生起到抑制作用。【结论】改进的Landy合成培养基是ES-2菌株产生脂肽适宜的培养基,在抗菌脂肽生产中向培养基中加入合适种类的糖和氨基酸十分重要。     

Antagonistic Activities of Volatiles from Four Strains of Bacillus spp. and Paenibacillus spp. Against Soil-Borne Plant Pathogens

The four effective antagonistic Bacillus strains, isolated from the rhizosphere soil of cucumber in a greenhouse, produced antifungal volatiles. These volatiles strongly inhibited the growth of the most tested pathogenic fungi with wide host plants, induced the mycelial morphological abnormalities, and decreased the sclerotoid production of Sclerotinia sclerotiorum in sealed plates. Spores of Botrytis cinerea exposed to these volatiles for 24-48 h in cavity slides cracked and the sporaceous inclusion became brown and effused to the suspension. An interesting phenomenon observed was that all the bacterial volatiles exhibited intense inhibitory activities against the pigment formation of tested pathogenic fungi, including Ascochyta citrullina, Alternaria solani, Alternaria brassicae, and so on. Interactions mediated by microbial volatiles could be widespread in soils, and volatiles may play an important role in reducing disease levels. A phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequence placed the four bacteria in three species Paenibacillus polymyxa （BMP-11）, Bacillus subtilis （BL02）, and Bacillus pumilus （BSH-4 and ZB 13）. Through headspace sampling and GC-MS analysis, a rich profile was found from B. subtilis and overlapping volatile patterns could be found among the different species. Studies are under the way to find the possible action mechanisms and to seek the effective application of bacterial volatiles in greenhouse.     

微黄青霉ZF1及其代谢产物对禾谷镰孢的抑菌活性

【目的】对前期从土壤中筛选获得的1株具有生防效果的微黄青霉（Penicillium minioluteum）ZF1,进一步分析其对禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的抑菌效果,以及其培养滤液与化学药剂混配的抑菌能力和对玉米叶片、籽粒的侵染能力,明确该生防菌的开发利用价值,为防治禾谷镰孢引起的玉米茎腐病和穗腐病提供依据。【方法】采用菌丝生长速率法测定微黄青霉ZF1对禾谷镰孢的抑菌能力,微黄青霉ZF1培养滤液对禾谷镰孢的抑菌作用;通过玻璃纸法测定微黄青霉ZF1次生代谢产物对禾谷镰孢菌落生长的影响;比较咯菌腈、微黄青霉ZF1菌株培养滤液及咯菌腈和培养滤液混配3个处理对禾谷镰孢菌丝生长的抑制作用;分别在5叶期和乳熟期检测微黄青霉ZF1对玉米叶片和籽粒的侵染能力。【结果】微黄青霉ZF1能够明显抑制禾谷镰孢生长,抑制作用达到81.33%,抑菌面积为16.21 cm²;去玻璃纸PDA培养基上,ZF1菌株次生代谢产物对禾谷镰孢生长的抑制作用达到55.46%;菌株培养滤液稀释10、20、50和100倍后对禾谷镰孢菌抑制作用分别为81.04%、64.46%、22.67%和1.12%,但微黄青霉培养滤液对禾谷镰孢菌丝形态影响不明显;咯菌腈和微黄青霉菌培养滤液复配后对禾谷镰孢的抑制作用比二者单独使用有所增强,咯菌腈抑制禾谷镰孢菌丝生长的EC₅₀和EC₉₅值分别为0.0162和0.5287 μg·mL^-1;10%微黄青霉菌培养滤液和0.5 μg·mL^-1咯菌腈对禾谷镰孢的抑制率分别为86.45%和95.13%,二者复配后降低了对禾谷镰孢菌丝生长的EC₅₀和EC₉₅值,延长了作用时间,EC₅₀和EC₉₅值分别为0.0023和0.4011 μg·mL^-1,培养4 d后咯菌腈抑菌作用丧失,而0.5 μg·mL^-1咯菌腈与10%微黄青霉菌培养滤液复配后较0.5 μg·mL^-1咯菌腈单独作用时间延长了10 d。接种微黄青霉至玉米叶片和受伤的玉米籽粒,仅在叶片表面和伤口处产生微寄生霉层。【结论】微黄青霉ZF1菌株及其培养滤液对禾谷镰孢均有明显的抑制作用,咯菌腈和培养滤液复配对禾谷镰孢的抑制作用优于单独使用咯菌腈的处理。研究结果可为微黄青霉菌的开发应用提供依据,为禾谷镰孢茎腐病和穗腐病的防治开辟新途径。     

木本植物粗提物对桉树焦枯病菌的抑制作用

桉树焦枯病成为制约桉树生产的重要因素之一,使用环境友好型的杀菌剂是防控桉树焦枯病的有效途径之一。植物源抑菌剂由于具有生态安全的特点,已作为开发新型农药的重要成分而备受关注。以广玉兰、银杏、八月桂等11种植物为供试材料,分别用蒸馏水和无水乙醇进行低温浸提,研究粗提物对2种桉树焦枯病病原菌类柯氏丽赤壳和瑞丽赤壳的生长抑制作用。结果表明,在1 g·mL-1的浓度处理下,对桉树焦枯病菌瑞丽赤壳抑制效果最好的是银杏水粗提物,抑制率达到了100%;其次是红花檵木水粗提物,抑制率达到了94.28%;广玉兰无水乙醇粗提物对桉树焦枯病菌类柯氏丽赤壳的抑制效果最好,抑制率达到了73.36%;银杏、红花檵木和广玉兰在开发桉树焦枯病新型抑菌剂中具有潜在价值。     

生防菌Bs916合成脂肽抗生素泛革素的 操纵子结构功能及生物活性

【目的】明确枯草芽胞杆菌Bs916（Bacillus subtilis 916）分泌的脂肽化合物Fengycin操纵子的结构、功能和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治真菌病害的分子作用机制。【方法】在Bs916全基因组测序基础上,采用LA-PCR方法克隆Fengycin的操纵子Fen;通过生物信息学方法分析Fen操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Fen操纵子合成的脂肽类化合物中同系物的分子量;采用同源重组方法构建Fengycin突变株BSFG;通过抑菌活性和溶血活性试验测定突变株BSFG的生物活性。【结果】克隆到Bs916基因组DNA中全长约37.67 kb的Fen操纵子,含有5个开放阅读框架分别编码FenA、FenB、FenC、FenD和FenE多功能复合酶;与Bs168对应Fen操纵子的同源性为65%。根据该操纵子特征推测其编码的脂肽类化合物为Fengycin;Fen操纵子负责合成的Fengycin包含5个变异体,分属于两类不同同系物。同系物1的质子化峰分子量分别为1 449.8、1 463.9、1 477.9;属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,一级结构为[cyclo-（[cyclo-（Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln- Tyr-β-amino fatty acid）];同系物2的质子化峰分子量分别为1 491.9和1 505.9,也属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,相对于同系物1其第6位的Ala氨酸残基变为Val氨酸残基。生物活性测定结果表明突变株BSFG抗菌活性相对于野生型菌株Bs916得到显著下降,但溶血活性的变化不明显。【结论】本研究克隆了生防菌Bs916中合成Fengycin的完整操纵子,通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了Fengycin的5种变异体的化学结构,并阐明了脂肽Fengycin是Bs916抗真菌活性的重要因子之一。     

灰葡萄孢菌不同发酵方式次生代谢产物的生物活性

对灰葡萄孢菌固体和液体发酵后的次生代谢产物乙酸乙酯粗提物进行抑菌、杀虫活性研究,结果表明:用于测试的5种真菌病原菌中,固体发酵粗提物对烟草赤星病菌和稻瘟病菌的菌丝生长有很高的抑制活性,对番茄早疫病菌、菜豆炭疽病菌、梨黑星病菌和稻瘟病菌的孢子萌发有很高的抑制活性;液体发酵粗提物对番茄早疫病菌、梨黑星病菌的菌丝生长和菜豆炭疽病菌的孢子萌发有非常高的抑制率.对2种细菌病原菌烟草野火病菌和白菜软腐病菌,固体、液体发酵粗提物抑制生长率均高达80%以上,但固体稍高于液体发酵粗提物;在杀虫方面,固体发酵粗提物对桃蚜触杀作用明显高于液体发酵粗提物.     

食品防腐剂的分子结构和抗菌活性的关系

综述了抗菌剂的生理作用有三种 :抗菌剂的化学作用、物理作用、结构作用 ,并重点论述了抗菌剂的分子结构与抗菌活性的关系 ,并对其抗菌机理和构效关系进行了阐述     

Lipopeptide Antibiotics Produced by the Engineered Strain Bacillus subtilis GEB3 and Detection of Its Bioactivity

MALDI-TOF-MS technology was used for identification of lipopeptide antibiotics produced by GEB3 strain,a derivative of Bacillus subtilis 168 which was transformed by lpaB3gene.The result showed GEB3 only produced lipopeptide antibiotic surfactin.The analysis by LC-MS demonstrated that GEB3 produced standard surfactin isoforms with side chain lengths of 13,14 and 15 carbon atoms.The bioactivity detection of surfactin indicated that the surfactin produced by GEB3 had inhibition effect on plant pathogens Rhizoctonia solani and Pyricularia oryzae.     

基因工程菌枯草芽孢杆菌GEB3产生的脂肽类抗生素及其生物活性研究

 利用MALDI TOF MS技术 ,鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明 ,GEB3仅产生表面活性素 (surfactin) 1种脂肽类抗生素。经LC MS分析 ,GEB3产生由 13、14和 15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体 (standardsurfactinisoforms)。生物活性检测表明 ,该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用     

枯草芽孢杆菌Bs916中脂肽抗生素Bacillomycin L的操纵子结构及生物活性

【目的】明确枯草芽孢杆菌Bs916(Bacillus subtilis 916)分泌的脂肽化合物Bacillomycin L操纵子、结构和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治病害的分子生化机制。【方法】采用LA-PCR和基因步行的方法克隆bacillomycin L的操纵子Bac;通过生物信息学的方法分析Bac操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Bac操纵子合成的脂肽类化合物bacillomycin L的分子量;利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片测定bacillomycin L肽端的一级结构;通过平板对峙实验和溶血活性试验测定bacillomycin L的生物活性。【结果】克隆到全长约39.0kb的Bac操纵子,该操纵子由BacD、BacA、BacB和BacC4个多功能复合酶及1个启动子组成;生物信息学分析表明Bac操纵子与脂肽类化合物iturinA、mycosubtilin、bacillomycin D操纵子具有很高的同源性,然而也发现一段低同源性区域,该区域是一个新型Ser激活结构域。根据Bac操纵子特征推测Bac操纵子编码的脂肽类化合物可能是Bacillomycin L;Bac合成的脂肽类化合物的分子量分别为:1008,1022,1036和1050Da;推测属于相差一个(-CH2)亚甲基的同系物;脂肽化合物的一级结构为[cyclo-(Asn-Tyr-Asn-Ser-Glu-Ser-Thr-β-amino fattyacid)],该一级结构与以前报道的bacillomycin L的肽序列一致。生物活性测定结果表明其是一种生物表面活性剂,具有广谱抗真菌活性。【结论】本研究克隆了bacillomycin L的完整操纵子,并通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了枯草芽胞杆菌Bs916分泌的脂肽bacillomycin L的化学结构,并阐明了生防菌Bs-916分泌的脂肽bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子。