2个玉米光敏色素C基因的克隆及功能验证

为了研究玉米与拟南芥光敏色素C(Phytochrome C,PHYC)功能的异同,以及2个玉米PHYC基因在光形态建成和避荫性反应中的作用,克隆了玉米2个PHYC基因,用生物信息学方法分析玉米PHYC蛋白结构域,与常见物种PHYC蛋白进行系统进化分析,并利用转基因技术在拟南芥中验证玉米PHYC基因的功能.结果表明,从玉...     

植物避荫反应信号转导途径研究进展

植物避荫反应是指细胞内各种形式的光信号受体相互作用,在感受到植物被遮荫后引起茎秆伸长的反应.首先介绍了树冠遮荫造成的光环境及其光信号受体,红光(680 nm)/远红光(730 nm)量子比率R:FR,是植物避荫反应中重要的信号分子;植物避荫反应的光受体有光敏色素、隐花色素、向光素和UVR8蛋白,介绍了它们在光信号感受中的不同作用目标和生物功能;重点讨论了光敏色素相互作用因子(Phytochrome Interacting Factors,PIFs)和光敏色素、植物激素的相互作用及其调控植物避荫反应的分子机制;并介绍组成型光形态建成1 (constitutive photomorphogenesis 1,COP1)蛋白在避荫反应调控中的作用;最后对夜晚和光斑环境下的植物避荫反应调控机制作了简要概述.     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术在茎瘤芥幼苗叶片中克隆了茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段,命名为BjPHYB1(GenBank登录号:JQ178243)。结果表明,该片段长1 544 bp,编码514个氨基酸;该氨基酸序列包含两个完整的PHYB保守结构域PHYTOCHROMEREGION和PAS DOMAIN,且与甘蓝和拟南芥PHYB同源性分别为98%和96%;系统进化树分析表明BjPHYB1与同科植物的PHYB亲缘关系较近。茎瘤芥PHYB基因片段为首次克隆,为今后对该基因功能研究奠定了基础。     

利用修饰光敏色素信号途径进行作物改良的可行性

介绍了模式植物拟南芥中受光敏色素调控的光形态建成机制;综述了有关禾本科植物光敏色素信号途径及其突变体与产量性状关系的相关研究进展。指出：对小麦、玉米等作物光敏色素过表达和/或功能缺失突变体的株高、开花期、避荫性反应和产量等变异进行系统研究,对其产量性状突变体进行遗传学、生物化学和分子机制进行解析,有望探索出通过修饰作物的光信号途径改良农作物的新策略。     

拟南芥光敏色素基因PHYA转化菊花的研究

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物的重要光受体,拟南芥包含PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5个光敏色素基因,它们在植物的生长发育中起着重要作用,光敏色素基因的过量表达通常造成转基因植株株型及光合效率的改变.从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊"粉地毯",得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系.结果发现,与对照相比,在弱光环境下转基因植株节间变长,叶片瘦长,叶柄变长;在露天栽培条件下,转基因株系的叶片变大,叶片着生密,节间变小,株型明显矮化.转基因株系的另一明显表现型是花期显著提前,转基因植株的花色也由粉色变为黄色,拟南芥PHYA基因的过量表达同时也影响了地被小菊生长发育的诸多方面,为PHYA基因在植物基因工程中的应用提供了借鉴.     

一个光敏色素B调控的水稻NBS-LRR基因的表达模式分析

利用水稻基因芯片比较野生型、phyA和phyB突变体受连续红光照射后的基因表达图谱,从中筛选到一个受光敏色素B(phyB)介导的红光信号特异诱导的、编码NBS-LRR类蛋白的基因,命名为PB-LRR(phyB-regulated NBS-LRR).为了揭示PB-LRR基因在水稻生长发育中的作用,对该基因表达的器官特异性...     

西瓜ClP5CS基因克隆及其功能研究

【目的】克隆西瓜自交系M08的ClP5CS基因(Cla006553和Cla017928)cDNA序列全长,探究其在抵御干旱和盐胁迫中的作用。【方法】利用西瓜基因组信息,以M80幼叶为材料,克隆Cla006553和Cla017928的编码序列,对其氨基酸序列进行生物信息学分析和同源分析;构建这2个基因的过表达载体转化农杆菌,采用浸花法浸染拟南芥,选取相应转基因T2拟南芥株系,检测其在脱落酸(ABA)、甘露醇、NaCl及干旱胁迫下的发芽率、根长、成活率及脯氨酸含量,研究Cla006553和Cla017928对拟南芥抗逆性的影响。【结果】Cla006553编码序列长2 166bp,编码721个氨基酸;Cla017928编码序列长2 145bp,编码714个氨基酸。Cla006553与Cla017928的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性为分别为74.19%和77.12%,其氨基酸序列中含有ATP结合位点、脯氨酸反馈抑制位点、亮氨酸拉链、谷氨酰激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株在ABA、甘露醇、NaCl和干旱胁迫下的发芽率、根长、脯氨酸含量、成活率等均高于对照,具有较好的耐旱和耐盐能力。【结论】克隆了西瓜P5CS的2个编码基因Cla006553和Cla017928,这2个基因均可增强转基因拟南芥植株的抗逆能力。     

过表达胡杨PePKS5提高拟南芥耐盐性

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分,在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上,探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因,并在拟南芥中过表达,获得T₃代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型,测定其过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na⁺、K⁺动态离子流,利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na⁺和H₂O₂含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标,揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体,通过瞬时转化烟草,对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】(1)PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸,PePKS5氨基酸序列与...     

2个玉米光敏色素C基因的转录丰度对多种光质处理的响应

【目的】通过NCBI数据库获得2个玉米PHYC及相关数据,并进行相关生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析2个玉米PHYC在玉米各器官的转录丰度,以及其转录丰度对多种光质处理、黑暗到各种光质转换和光周期处理(长日照和短日照)的响应,为研究玉米PHYC在玉米幼苗去黄化与开花期的调控机制奠定基础。【方法】采用玉米B73自交系为研究材料,通过RT-PCR分别对Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF序列进行克隆;借助相关软件对其进行生物信息学分析,利用q RT-PCR分析这两个基因在玉米各器官中的转录丰度,及其转录丰度对各种光照处理的响应。【结果】Zm PHYC1和Zm PHYC2的全长ORF均为3 408 bp,编码1 135个氨基酸基序,分子量分别为126.14和126.07 k D。生物信息学分析表明,玉米phy C蛋白可以分为6个功能区段:节奏周期蛋白—Ah核转运接受蛋白—专一蛋白区段(Per-Arnt-Sim,PAS)、c GMP受激磷酸二酯酶区段(GAF)、色素区段(PHY)和PAS相关区段(PRD,包含2个PAS区段)、组氨酸激酶A区段和组氨酸激酶ATP酶区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅有一个PAS区段。氨基酸水平的系统发育树分析表明,Zmphy C1和Zmphy C2与禾本科物种phy C有很高的一致性,且与甘蔗和高粱phy C的亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达在根和叶中的转录丰度均较高,同时对持续蓝光和白光响应强烈;在黑暗到各种光质转换处理中,这两个PHYC的表达模式相似。在黑暗转到远红光、红光、蓝光和白光的0.5 h,Zm PHYC1和Zm PHYC2的转录表达均急剧上升,随后迅速下降到自身起始黑暗时的水平以下,并上下波动。这两个基因对长日照和短日照的光周期处理也能积极响应,在长日照条件下,2个Zm PHYC出现了极其相似的表达模式,均在光照和黑暗阶段各出现1个峰值;在短日照条件下,这两个基因的表达模式差异较大,Zm PHYC1的峰值出现在进入黑暗后6 h,而Zm PHYC2的峰值出现在进入光照阶段2 h。【结论】玉米phy C蛋白可以分成6个功能区段,但是Zmphy C2在PRD区段仅具有一个PAS相关区段。2个玉米PHYC转录丰度具有组织特异性。在各种光质处理中,Zm PHYC1和Zm PHYC2的表达模式相近,可能二者存在功能冗余,在转录水平上前者的丰度高于后者,推测Zm PHYC1在玉米中起更重要的作用,并且可能二者在功能上存在分工。Zm PHYC1和Zm PHYC2对各种光质和光周期处理均有较强的响应,推测二者在调控玉米光形态建成和开花中具有重要作用。     

大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2的克隆及功能分析

【目的】对大豆（Glycine max）水杨酸结合蛋白基因GmSABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为GmSABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在盐和干旱处理条件下GmSABP2的表达特性。利用Gateway技术构建植物表达载体pEarleyGate103-GmSABP2,转入根癌农杆菌EHA105,利用蘸花法侵染拟南芥,经抗性筛选得到转基因株系。对野生型植株和转基因植株进行盐和干旱胁迫处理,并统计在胁迫条件下两者的种子萌发率、主根长和成熟植株的存活率。【结果】克隆得到GmSABP2的cDNA序列,序列全长1 235 bp,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸,分子量为29.15 kD,等电点为5.58。氨基酸序列比对发现大豆和毛白杨、可可以及烟草相似度较高。利用NCBI的CD-search发现大豆SABP2序列中存在一个Abhydrolase_6（pfam：12697）水解酶保守结构域。大豆SABP2蛋白属于α/β水解酶超家族。应用MEGA程序构建多物种的系统发生树,发现大豆和毛白杨及可可亲缘关系较近,而与拟南芥亲缘关系较远。对大豆幼苗胁迫后的表型分析发现,在盐和干旱条件下大豆幼苗均受到明显的胁迫效应。Real time-PCR分析表明大豆幼苗叶子中的GmSABP2在盐和干旱处理条件下均上调表达。拟南芥耐逆性分析发现,在正常培养条件下,野生型植株和转基因株系均能正常萌发、生长。在高盐（150 mmol·L^-1 NaCl）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为38%,12 d大小幼苗主根长为0.4 cm,成熟植株的存活率为49%;转基因株系的种子萌发率为67%,12 d大小幼苗主根长为1.1 cm,成熟植株的存活率为78%。在模拟干旱（20% PEG6000）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为31%,12 d大小幼苗主根长为0.5 cm,成熟植株的存活率为36%;转基因株系的种子萌发率为57%,12 d大小幼苗主根长为1.0 cm,成熟植株的存活率为66%。【结论】GmSABP2在拟南芥植株对盐和干旱的抗性中有一定的作用。     

白菜硫代葡萄糖甙合成中MAM 的进化分析

【目的】探索硫代葡萄糖甙合成中关键基因-甲基硫代烷烃基苹果酸合成酶（methylthioalkylmalate,MAM）基因在白菜基因组中的进化情况,为研究白菜MAM的功能提供理论指导。【方法】根据白菜数据库BARD信息分析拟南芥、盐芥和白菜MAM的共线性关系,利用MEME在线软件预测MAM序列的高度保守基序（motif）,通过R软件分析93份白菜材料MAM的表达模式,并利用MEGA5.05软件构建MAM的系统进化树。【结果】白菜的3个亚基因组均保留着MAM的同源基因。其中与拟南芥具有共线性的5个同源基因可能源自基因组古三倍化复制,其它两个同源基因可能是由转座扩增产生的;基序分析结果表明,与拟南芥的MAM相比,白菜的MAM同源基因存在基序的缺失,并且大多发生在序列的两端;在93份白菜材料中,白菜MAM同源基因之间的表达量有很大差异,Bra021947与Bra018524只在少数材料中存在极低的表达,并且Bra029356的表达量低于可检测水平;进化树分析发现,除Bra018524外,其他的白菜MAM同源基因与拟南芥的MAM聚集在不同的分支上。【结论】白菜的MAM可能在拟南芥和白菜物种分化之后独立起源并进化出不同的功能。     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

SSMP的结构解析及在拟南芥抗盐过程中的作用

【目的】解析SSMP（salt-sensitive membrane protein）的结构,明确SSMP的表达特性,预测和分析SSMP在拟南芥逆境胁迫过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,解析SSMP的结构特征;利用Real-time PCR技术分析SSMP的时空表达特性;利用SSMP-GFP融合技术转化拟南芥叶片原生质体,对SSMP进行亚细胞定位;构建SSMP的启动子连接报告基因GUS的表达载体,转化野生型拟南芥,通过染色方法观察报告基因GUS的表达情况,从而进行SSMP的组织定位分析;构建SSMP过表达载体,利用农杆菌侵染花絮法转化拟南芥,qRT-PCR技术验证过表达SSMP拟南芥阳性苗,分析过表达SSMP拟南芥的表型并进行抗逆性分析,明确SSMP的生物学功能;利用电导仪法比较过表达SSMP拟南芥和野生型拟南芥叶片的细胞膜透性,分析SSMP在拟南芥抵抗逆境胁迫过程中的作用。【结果】生物信息学分析表明,SSMP含有START（the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains）保守域、共411个氨基酸,具有磷脂酰胆碱的结合位点,预测SSMP可能影响膜的组成。对SSMP的高级结构进行解析,SSMP含有9个反平行的β-折叠和2个α-螺旋,形成1个明显的疏水腔,N端的α-螺旋在疏水腔外,另一个α-螺旋形成疏水腔的盖子结构。Real-time PCR对拟南芥的不同组织及发育时期的SSMP表达量的分析表明,SSMP在拟南芥各组织中均有表达,表达量由高到低的顺序依次为茎生叶、莲座叶、茎、根、花和种子。SSMPpro::GUS转基因拟南芥幼苗的染色结果表明,在正常情况下,GUS主要在下胚轴、整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛处表达;50 mmol·L^-1 NaCl处理后,GUS在下胚轴和子叶中表达没有明显的变化,但在真叶中的表达减少;100 mmol·L^-1 NaCl处理后,GUS的表达在下胚轴、子叶和真叶中都明显减少,子叶中GUS主要在叶脉处表达,在真叶中仅在顶端还有表达,这说明SSMP的表达受NaCl抑制。激光共聚焦显微镜488 nm波长下对SSMP-GFP的亚细胞定位进行观察,SSMP主要定位在细胞质膜上。过表达SSMP转基因拟南芥的细胞膜透性增加,不利于植物的抗逆性。进一步的萌发试验对过表达SSMP的转基因拟南芥的萌发率和转绿率进行了统计分析,结果表明,过表达SSMP明显抑制拟南芥种子的萌发。【结论】SSMP是具有磷脂酰胆碱结合位点的共411个氨基酸的蛋白质,含START结构域,主要位于细胞质膜上;在拟南芥各组织中均有表达,尤其在叶片中表达量最高,主要定位在整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛着生处;SSMP的表达受盐胁迫的抑制;过表达SSMP的拟南芥细胞膜透性增加,耐盐性降低。     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据.[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较.[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异.[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响.     

盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长的全基因组关联分析

【目的】解析甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的调控位点,筛选油菜耐盐性相关的候选基因,可为油菜耐盐性改良提供依据。【方法】以317份具有代表性的甘蓝型油菜自交系为材料,在正常生长和盐胁迫条件下进行沙培鉴定,利用芸薹属60K SNP芯片和全基因组关联分析鉴定正常生长与盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴长度显著关联的SNP,并确定其连锁不平衡区间。通过区间内基因的功能注释及盐胁迫下油菜幼苗根和叶片转录组差异表达基因筛选连锁不平衡区间内的重要候选基因,并以实时荧光定量PCR分析候选基因的组织特异性和盐胁迫诱导表达模式,提高候选基因筛选的准确性。【结果】正常生长和盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长在不同材料间变异较大,频次分布表明目标性状均为数量性状,受多基因调控。全基因组关联分析模型比较表明,MLM+P+K模型为最优模型。以此模型对目标性状进行全基因组关联分析,检测到45个显著关联SNP,其中40个与下胚轴长度显著关联,5个与根长显著关联,单个SNP解释的表型变异分别为9.12%—14.46%和7.67%—8.93%。重复检测的显著相关SNP中,值得注意的是C04染色体的rs8970,同时与4个性状显著关联,表型贡献率为7.67%—12.35%,是唯一在下胚轴长和根长间重复检测到的显著关联SNP。11个重要关联SNP中有6个位于10—442 kb的连锁不平衡区块中。转录组分析表明,11个连锁不平衡区间共包含447个基因,其中15个受盐胁迫诱导表达。转录组和基因功能注释综合分析表明,BnaSRO1、BnaPAGR2、BnaNPH3、BnaMYB124、BnaSAM-Mtase、BnaBIN2、BnaUMAMIT11、BnaEXPA7、BnaRPT3、BnaEF-hand和BnaF3H很可能为各自区间的候选基因。实时荧光定量PCR结果证实除BnaNPH3外,其他基因均在根或下胚轴中受盐胁迫诱导上调表达。组织特异性分析还发现BnaUMAMIT11、BnaPAGR2和BnaEXPA7主要在萌发的根和下胚轴中特异表达,BnaRPT3、BnaBIN2和BnaMYB124虽然呈组成型表达,但在萌发阶段的下胚轴中表达量最高,证实这些基因很可能参与油菜发芽期根和下胚轴生长发育及耐盐性的调节。【结论】全基因组关联分析共鉴定出45个控制油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的显著关联SNP。连锁不平衡、转录组和基因功能注释综合分析初步鉴定出11个重要候选基因。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。