CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是在DNA双链的特定位置形成双链断裂,然后通过同源重组或非同源末端连接方式进行修复,造成基因组碱基局部缺失或插入而引起基因突变,它具有操作简单、突变效率高等优势。笔者归纳了CRISPR/Cas9系统的基本结构、分类及其在植物基因中的研究进展和未来的发展方向。     

CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展

基因编辑技术的发展与应用为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要的技术支撑。近年诞生的CRISPR/Cas基因编辑系统(主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a)与其他的基因编辑技术相比,具有操作简单、效率高等优势,因此在动植物中均得到广泛应用。本文结合CRISPR/Cas基因编辑技术体系的发展历史及最新研究进展,着重介绍了该技术在植物领域中的应用范围和发展方向,以及基因编辑植物的靶点分析方法;对目前CRISPR/Cas基因编辑技术体系存在的问题进行了分析并提出了改进策略。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述,旨在为相关领域研究提供参考。     

CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及研究进展与应用

CRISPR/Cas系统是一种从细菌和古生菌中衍生而来的适应性免疫系统,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的"记忆",从而防止外来DNA片段的侵袭。CRISPR/Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势已经成为改良作物的新一代基因组编辑技术。本文从CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展及其在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行定向编辑,在植物基因功能研究和遗传改良中具有巨大的潜在应用价值,因其具有高效、操作便捷及成本低的特点,成为当前基因组编辑技术的主流。概述了CRISPR/Cas9系统的起源、分类、作用机制及其在农作物和林木基因功能验证和遗传改良中的应用,并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了探讨。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用

CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。总结了CRISPR/ Cas9基因组定向编辑技术的发展历程,并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来质体或者噬菌体。 根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同,已发现的CRISPR/Cas系统可以分为3种不同类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅱ型是以Cas9蛋白及导向RNA为核心组份,组成较为简单,是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自CRISPR/Cas9技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后,经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中。CRISPR/Cas9与ZFNs或TALENs一样都是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂,然后通过非同源末端连接或同源重组介导的修复2种方式引入突变。至今,在多种作物中已实现诱导产生多种定点突变（包括插入、缺失或修饰等）,并可获得较高的突变诱导率和可稳定遗传的基因组编辑后代植株。与ZFNs或TALENs技术相比,CRISPR/Cas9技术可以实现对基因组中多个靶基因同时进行编辑,从而可以用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因,为其一大优势。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低、易于操作及可以多重基因编辑等特点,已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。CRISPR技术除了可以对基因组中不同靶基因进行定向编辑以外,还可以广泛地应用于基因表达调控研究、细胞定位运输系统研究及新型RNA沉默系统构建等方面。基因组编辑技术是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。但是,与转基因技术相比,CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简单、快捷。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行育种可以不引入外源基因,在进行基因组编辑之后可以不留下转基因的痕迹,从而导致定义转基因生物的不明确性,因此,政府监管部门是否应该按照转基因的管理办法来监管CRISPR/Cas9技术的应用尚有待决定。     

基因编辑技术及CRISPR/Cas系统在草地植物开发中的应用

随着高通量测序技术的兴起,功能基因组学研究得以迅猛发展.基因组定点修饰技术作为一项研究特定基因功能的工具,对功能基因组学的研究具有极强的推动作用.CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫防御系统,在细菌、古细菌的长期演化过程中形成,用于对抗入侵的病毒及外源DNA.通过对各种基因编辑技术的对比,发现相比于DNA同源重组、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等技术,基于RNA指导的CRISPR/Cas系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路,在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等显著优点.从作用机制和发展历程等方面对目前基因编辑的4种技术进行简述,进一步总结CRISPR/Cas系统在经济林木、作物、植物病毒和牧草植物功能基因组编辑中的研究应用,以期为促进基因编辑技术在农牧生产中的应用提供参考.     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

[目的]OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程.利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11 (ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7...     

CRISPR／Cas9系统的研究进展及其在水稻上的应用

综述了CRISPR/Cas9系统的结构、定点突变原理、载体构建类型及介导突变的可遗传性,着重分析了影响突变效率的因素,介绍该系统目前在水稻上的研究,并展望其应用前景。     

利用 CRISPR/Cas9 技术定向编辑水稻 OsIQD1 基因

【目的】植物特异性 IQD 家族蛋白质是一类植物特有的钙调素结合靶蛋白,在植物的生物防 御和发育调节中发挥重要作用。前期酵母双杂筛选试验表明,Pik-H4 与 OsIQD1 存在互作关系,为进一步 揭示 OsIQD1 在水稻抗稻瘟病中的生物学功能,利用 CRISPR/Cas9 编辑技术对 OsIQD1 基因进行定点编辑。 【方法】通过序列比对获得水稻 OsIQD1。在 OsIQD1 第 1 外显子和第 5 外显子（DUF4005 结构域）区域设计 2 个 20 bp 的编辑靶点,将 2 个靶点核苷酸片段克隆至 pRGEB32 载体,获得 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 载体,利用 农杆菌介导法转化水稻 Pik-H4 NIL 愈伤组织,经再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对 T0 代转基 因植株靶点区域序列进行 PCR 和测序,分析 osiqd1 的突变类型。【结果】转基因再生植株经过对抗潮霉素基因 HPT Ⅱ的 PCR 鉴定,获得 30 株阳性株系。对 T0 代植株靶点附近序列的测序结果表明,OsIQD1 基因被成功编 辑,两个位点的编辑效率分别为 21.67% 和 26.67%,其中,靶点 2 区域有 1 个纯合突变株系。【结论】研究结 果为进一步利用 osiqd1 突变体开展其参与钙离子 / 钙调素信号转导通路的机制研究提供了遗传材料,初步推定 OsIQD1 参与植物的基础免疫反应。     

CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展

概括了CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理,分析了该系统的不足,重点阐述了该技术在林木基因组编辑中的应用,并对CRISPR/Cas9系统的未来研究趋势进行了展望。     

香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。