进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L^-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。     

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

【目的】建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的方法,为非洲猪瘟（African swine fever, ASF）的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持。【方法】首先,以ASFV中国流行毒株（GenBank: MK333180.1）的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法。设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至pOK12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品。将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性。最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFV p72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率。另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测。【结果】利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800 bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×10¹-1.56×10⁸拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为：y =-3.295 lg(x) + 45.995,线性相关系数R²为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL。在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好。与最低检测限为1.56×10⁴拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性。在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P = 0.5>0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867>0.75,P<0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株。【结论】建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持。     

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。     

柑橘黄龙病早期诊断的PCR检测技术优化

柑橘黄龙病是柑橘属植物主要病害之一,是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起的病害,病菌可随筛管转运至整个植株,其潜伏周期长、危害面积广,严重威胁我国乃至世界范围内柑橘产业的健康发展。因此,早期柑橘黄龙病的快速检测是病害防治重要环节,目前最常用的是基于PCR技术的检测方法,但由于植株体内的病菌含量较低、PCR扩增体系中引物稳定性的差异、DNA模板浓度的不同均会对扩增效果有较大影响。本研究以感染黄龙病的柑橘叶片作为样本,提取叶片DNA作为模板。利用LSS606/LAS、16sf/16sr、A2/J5、P1/P2和OI1/OI2 5对柑橘黄龙病检测引物对PCR反应体系进行了优化。结果显示,除了OI1/OI2引物的特异性较差外,其余4种引物均表现了很好的特异性,引物浓度在0.2~0.3 μmol时,PCR扩增效果较好。灵敏度检测显示引物LSS606/LAS、A2/J5对模板DNA的灵敏度较高,在模板浓度为0.048 ng·μL^-1时仍能扩增出目标产物,分别是引物16sf/16sr和P1/P2检测灵敏度的10倍和20倍,可检测出1 ng总DNA中的柑橘黄龙病菌数在426~755。该研究通过特异性引物的筛选以及PCR检测体系的优化,确定了一种快速准确检测柑橘黄龙病的方法,为柑橘黄龙病的早期诊断奠定基础。     

跨膜蛋白39A基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3.937×10⁸~3.937×10³拷贝·μL^-1范围内呈良好的线性关系,R²可达0.999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3.937×10² 拷贝·μL^-1;组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。     

牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×10¹拷贝/μL，在8.26×10³～8.26×10⁸拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。     

奶牛隐性乳房炎三种致病菌的多重PCR检测方法的建立

为建立快速并能同时检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种奶牛隐性乳房炎致病菌的方法,根据无乳链球菌16S rRNA基因、金黄色葡萄球菌NUC耐热基因、绿脓杆菌ETA基因序列并参考文献各合成一对特异性引物,通过对PCR反应各项参数的调整优化,建立多重PCR检测体系,并同时进行灵敏性试验和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出无乳链球菌270 bp、金黄色葡萄球菌153 bp和绿脓杆菌375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1 500 bp的通用片段,而对于其他的6种病原菌只能扩增出1 500 bp的通用片段,具有较强的特异性。三种特异性引物扩增条带与GenBank上的细菌基因序列同源性为99%。增菌培养24 h,该体系对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低灵敏度分别为8×10⁴、4×10⁴、1.5×10⁵ CFU·mL^-1。本研究建立的检测方法能够完成无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的快速检测,对于生产上奶牛隐性乳房炎的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用

【目的】猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)所引起的一种急性肠道传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征。PEDV与TGEV同属α冠状病毒,可以感染各年龄段猪只,尤其对仔猪的危害最为严重,可导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重经济损失。由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似,临床上很难区分,因此,建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义。本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)环介导间接PCR检测方法,用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断。【方法】根据Gen Bank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息,在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上,分别选取PEDV和TGEV核蛋白(N)基因序列的一段高度保守区,设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的TOC1基因片段两端,作为特异性标记的报告基因。此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为404、252bp。【结果】该方法特异性好,可单独或同时检测PEDV和TGEV,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型轮状病毒(RAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等常见猪源性病毒无交叉扩增;检测灵敏度高,对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL-1的核酸样品,两种病原的同时检测不影响检测灵敏度;采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和Sybr Green实时PCR对157份临床样本进行比较检测,3种方法的PEDV检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%,TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%;kappa检验结果,环介导间接PCR、Sybr Green实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%(κ≥0.90)【结论】环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV,是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

蝗虫微孢子虫套式PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫(Paranosema locustae)的套式PCR方法,为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以GenBank数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位RNA为目的基因,采用PrimerSelect软件设计两对特异的套式PCR引物P.L.-F1/P.L.-R1和P.L.-F2/P.L.-R2,将微孢子虫液用0.2 mol·L~(-1) KOH处理后得到的发芽液作为模板进行PCR扩增,建立以P.L.-F1/P.L.-R1为外侧引物、P.L.-F2/P.L.-R2为内侧引物的套式PCR,扩增产为分别为298和242 bp。对引物浓度、退火温度及循环数进行优化,建立套式PCR方法,以此方法对梯度稀释的微孢子虫液进行灵敏性检测,并对采自哈密地区巴里坤北山的蝗虫样品进行检测。同时对提取的微孢子虫液进行传统的显微镜检测,并比较两种方法的灵敏度。【结果】建立了蝗虫微孢子虫的套式PCR快速特异性检测方法,优化后的PCR反应体系均为20μL:Buffer(10×)2.0μL,d NTPs(10 mmol·L~(-1))0.3μL,TaqDNA酶(250 U)0.3μL,上、下游引物(10μmol·L~(-1))各0.3μL,微孢子虫发芽液(第2轮以第1轮产物10×稀释液为模板)1μL,加水补充至20μL;PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,第1轮60℃退火(第2轮62℃退火)30 s,72℃延伸20 s,共35个循环;72℃延伸10 min,10℃保存。灵敏度试验显示,检测的微孢子虫数量可以达到12.2个孢子/μL(DNA量为1.07 pg·μL~(-1))。应用建立的套式PCR方法,对采自新疆哈密地区巴里坤北山的240头蝗虫样品进行了微孢子虫检测,检测结果为23.3%的阳性,而显微镜检测结果阳性仅为3.8%。【结论】研究建立的套式PCR方法能够快速特异地检测蝗虫微孢子虫的感染,为蝗虫微孢子虫致病性研究及田间应用提供了技术支持。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾

【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。     

褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜（Toxoptera citricida）中柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%,表明该方法重现性好。获毒24 h单头橘蚜中CTV最低含量为2.5×103拷贝,最高含量为1.24×106拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测褐色橘蚜中的CTV,可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV的流行。     

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV （A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe （5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）和CIAV-Probe （5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×Reaction Mix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP （工作浓度40.0μmol/L）各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作浓度5.0μmol/L）各0.4μL,ALV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.4μL,CIAV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.8μL,以ddH₂O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。     

中国马铃薯疮痂病菌快速PCR检测技术

【目的】马铃薯疮痂病菌具有明显的组成多样性,通过筛选不同疮痂病菌的通用探针引物,建立针对该类病原菌的定性检测方法。【方法】以目前中国存在的不同致病种的代表菌株CPS-1（Streptomyces scabies）、CPS-2（S. galilaeus）、CPS-3（S. acidiscabies）、CPS-4（S. turgidiscabies）为材料,根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有毒素合成基因簇中的基因txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）等序列设计引物,对不同菌株的基因组扩增,选择特异性和稳定性较高的引物作为探针引物,经温度梯度筛选优化反应体系后建立成熟的检测技术。【结果】获得的通用检测引物B1/B2对所有致病菌株均表现较好的特异性,可稳定扩出目的条带,而非致病菌株均无条带。利用孢子稀释法验证建立的检测方法对菌株DNA的灵敏度为20 pg•μL-1,对孢子的检测阈值约为4.0 CFU/μL。对测试样品基因组扩增结果表明,疮痂病原链霉菌、病薯样品组织、病田土样均检测到目的条带,而非疮痂病原链霉菌、健康薯块组织、非病田土样和其它菌株均未扩出目的条带,说明该方法的特异性较好。【结论】建立了马铃薯疮痂病菌的定性检测方法,可实现对菌株、病组织和土壤样品的快速检测。