铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

【目的】通过研究铜绿丽金龟（Anomala corpulenta）气味结合蛋白11（odorant binding protein 11,OBP11）与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L^-1 IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78 μmol·L^-1。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol^-1,表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。     

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性

【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。     

黄绿绿僵菌悬乳剂与低剂量阿维菌素对Q型烟粉虱的联合防治作用

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）是重要的入侵农业害虫,已对众多常规杀虫剂产生了高度抗性。论文针对烟粉虱的高效治理问题,通过室内和田间联合应用昆虫病原真菌与化学农药,评价其是否对烟粉虱防治具有协同增效作用,为烟粉虱的有效防控提供新的途径。【方法】在前期试验已经筛选到一株对Q型烟粉虱毒力较高的黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride）菌株Mf96基础上,先于实验室条件下采用喷雾法,在3个浓度梯度（1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶个孢子/mL）的黄绿绿僵菌（Mf96）分生孢子悬乳剂中添加1.8%阿维菌素WP,分别配制成含0、15、30、45和60 µg·mL^-1剂量的1.8%阿维菌素WP溶液,并喷到Q型烟粉虱2龄若虫体表,检测其死亡率。在体视显微镜下记录单位面积内的孢子沉积数量。田间试验中,分别将黄绿绿僵菌Mf96菌株悬乳剂（1.0×10⁸个孢子/mL）和1.8%阿维菌素WP（60 µg·mL^-1）单用和混用后喷施于NC95烟草上,评价其对烟粉虱的防治效果。【结果】实验室条件下,Mf96菌株悬乳剂从第4 天到第8 天对“Q型”烟粉虱2龄若虫的LC₅₀从1 376降至183个孢子/mm²。Mf96菌株与阿维菌素（60 µg·mL^-1）混合作用7 d后,真菌LC₅₀从378降至46个孢子/mm²。低剂量的阿维菌素对黄绿绿僵菌Mf96菌株的分生孢子和菌丝生长没有影响。不同浓度黄绿绿僵菌（低、中、高）孢子悬乳剂分别与不同浓度阿维菌素（0、15、30、45 和 60 µg·mL^-1）复配处理后,Q型烟粉虱2龄若虫有不同僵虫率,其中以阿维菌素30 µg·mL^-1与黄绿绿僵菌高浓度悬乳剂复配处理Q型烟粉虱2龄若虫产生的僵虫率最高,达86.8%。对照（悬乳剂基础配方）和单独喷施阿维菌素处理中未见到僵虫。田间喷施真菌孢子悬乳剂、药剂和菌药混剂后5 d和10 d,菌药混用的Q型烟粉虱若虫虫口减退率均最高,分别为53.6%和85.7%;5个随机抽查时间得到校正防效变化趋势与虫口减退率趋势一致,25 d菌药混用的校正防效在所有处理中最高,达88.9%;5个随机抽查时间得到的对照组虫口减退率均为负值。【结论】黄绿绿僵菌Mf96菌株与阿维菌素联合在实验室和田间防治Q型烟粉虱均具有协同增效作用。因此,利用黄绿绿僵菌Mf96分生孢子悬乳剂与低剂量1.8%阿维菌素WP联合防治Q型烟粉虱是一项新的有效措施。     

中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%(V/V)进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L~(-1)后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构(PDB代码:1n8v)为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L~(-1),结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸(9-ODA),和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68μmol·L~(-1)。分子对接显示不同配基与CSP1的结合分别是通过与CSP1疏水腔中特定氨基酸残基(或借助于氢键)作用结合。典型的如CSP1与HOB相互作用过程中,预测主要由8个氨基酸残基贡献能量,包括4个疏水性残基(Phe30、Phe44、Leu70和Phe85),3个极性中性残基(Tyr26、Tyr27和Ser41)以及1个酸性残基(Asp40),其中Asp40中两个羧基上的氧原子分别与HOB苯环中羟基上的氧原子分别产生一个氢键。免疫电镜定位结果显示CSP1主要表达于板形感器周围附属支持细胞中,少量表达于感器内部,这与气味结合蛋白的定位存在明显区别。【结论】中蜂CSP1与两种蜂王信息素成分和某些植物花香成分具有较强的结合能力,集合了信息素结合蛋白和普通气味结合蛋白的功能和相似的作用模式,但其亚细胞定位与气味结合蛋白存在明显区别,显示化学感受类蛋白生理特征的多样性。     

桃小食心虫化学感受蛋白CSP16配体结合特性

【目的】桃小食心虫（Carposina sasakii）是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据。【方法】通过原核表达系统获得CsasCSP16蛋白,并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-pheny-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,从33种寄主挥发物和2种性信息素分子中筛选出与CsasCSP16结合亲和性高的配体分子。通过对CsasCSP16进行同源建模获得其三维结构模型,以CSPMbraA6（PDB ID：1N8U）为模板成功构建CsasCSP16的三维结构模型。使用Autodock Vina软件将CsasCSP16与亲和性高的配体分子进行对接,构建蛋白-配体复合物。然后使用GROMACS（2019.3）软件对复合物进行动力学模拟,从动力学模拟的平衡状态中选取100个构象,使用g_mmpbsa软件计算CsasCSP16与气味分子的结合能,并通过能量分解的方法预测关键氨基酸残基。【结果】成功构建了CsasCSP16的克隆表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。与35种配体分子的荧光竞争结合表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯有较强的结合活性,其Ki值分别为6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L^-1。分子对接的结果表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯的Vina Score值分别为-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。动力学模拟结果表明,CsasCSP16与气味分子复合物在50 ns内达到平衡状态,通过g_mmpbsa计算复合物的结合能,CsasCSP16-水杨酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的结合自由能分别为-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol^-1;最后,通过分解每个氨基酸贡献的结合自由能表明异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）贡献的结合能>3 kJ·mol^-1,因此推测这4种氨基酸在CsasCSP16结合气味分子的过程中发挥关键作用。【结论】桃小食心虫CsasCSP16能与寄主植物的多种气味分子结合,推测其可能在桃小食心虫对寄主植物的定位过程中发挥重要作用。异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16与配体分子结合的关键氨基酸位点。     

一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立

【目的】卡那霉素是一种在奶牛兽医临床常用药物,其在牛奶中的残留不容忽视。荧光微球作为一种新型的荧光示踪物,近年来在小分子快速检测方面呈现出独特的优势,试验开展了卡那霉素荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在为牛奶中卡那霉素药物的快速筛选提供新型有效的检测手段。【方法】采用戊二醛法和过碘酸钠法制备了两种卡那霉素的包被抗原（KANA-GA-OVA₁、KANA-I₂-OVA₂）,抗卡那霉素的单克隆抗体通过蛋白G免疫亲和柱进行纯化后,采用碳二亚胺法与荧光微球进行了共价偶联,成功制备了抗体-荧光微球标记物。免疫层析试纸条方法采用微孔测定法。包被卡那霉素包被抗原的NC膜作为固相载体,荧光微球标记的单克隆抗体与样品混合,在微孔膜的毛细管作用下,包被抗原和待测样本中的药物来共同竞争有限的单克隆抗体,通过荧光测定包被抗原结合的抗体量来评价待测样本中卡那霉素药物的含量。【结果】灵敏度试验表明,微孔中加入0、6.25、12.5、25、50、100、200 µg·L^-17个浓度梯度的标准品溶液,卡那霉素药物浓度的增加,试纸条T线的荧光强度逐渐减弱,呈现抑制状态,以无标准品抑制的荧光峰高值为F₀值,相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值,以F/F₀为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。利用Originpro 8.0 软件拟合,曲线符合四参数方程,R²为0.9998,IC₅₀值为24.8 µg·L^-1,线性范围（以20%-80%抑制率对应的浓度计算）为9.5-100 µg·L^-1,最低检出限（以10%抑制率对应的浓度计算）为5 µg·L^-1。准确度和精密度试验表明,以25、50和100 µg·L^-13个浓度添加水平,平均添加回收率为78.4%-92.7%,批内变异系数为10.8%-12.4%,符合残留检测的需求。特异性试验表明,试验建立的卡那霉素荧光微球免疫层析方法对其他常见的氨基糖苷类药物的交叉反应率均＜1%,说明方法特异性良好。【结论】所建立方法快速灵敏、简单有效,特异性好,具有推广价值。     

棉田烟粉虱的为害及其经济阈值分析

【目的】 研究烟粉虱对棉花为害性及棉田烟粉虱的防治指标,为棉田烟粉虱防控提供理论依据。【方法】 采用田间试验、田间烟粉虱虫量系统调查、棉花产量测定的方法,分析烟粉虱对棉花为害性及防治数据,建立棉田烟粉虱的经济阈值。【结果】 烟粉虱对棉花单株结铃数、单株籽棉重、皮棉单产等均有明显的影响,但对单铃重没有明显的影响;虫口密度(x)与棉花单株结铃数(Y₁)、单株籽棉重(Y₂)、皮棉单产(Y₃)等指标的回归方程分别为:Y₁= 12.242 e^{-0.008 x} (r = 0.912 7^**),Y₂= 29.07e^{-0.009 6x} (r=0.894 4^**),Y₃= 29.07 e^{-0.009 6x}(r=0.894 4^**),虫口密度与棉花单株铃重、衣分没有明显的相关关系。烟粉虱对棉花纤维长度有明显影响,虫量与棉花纤维长度(Y₄)回归方程为:Y₄ = -0.004 6x + 28.409 r=0.607^*。【结论】 烟粉虱影响棉花产量和品质。棉田烟粉虱的经济和阈值以若虫计为1.9头/cm²。     

基于EPG技术的烟粉虱两个品系取食行为的比较

【目的】Cardinium是烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的一种次生内共生菌。有研究表明Q型烟粉虱Cardinium品系（C⁺品系）与未感染品系（C^-品系）的寄主适合度有很大差异,但其产生差异的行为机制尚不明确。论文旨在研究两个Q型烟粉虱品系的取食行为差异,以期从行为学角度揭示两个品系适合度差异的原因。【方法】应用刺吸电位技术（electrical penetration graph, EPG）记录Q型烟粉虱C⁺品系和C^-品系在棉花与番茄上6 h的取食波形,然后对取食波形进行分类统计,共选取19个参数（非韧皮部参数11个,韧皮部参数8个）进行数据分析,比较这两个品系在非韧皮部和韧皮部的取食行为差异。【结果】共获得118个有效记录,其中在棉花上58个（C^-品系28个,C⁺品系30个）,在番茄上60个（C^-品系31个,C⁺品系29个）。在取食棉花的非韧皮部阶段,烟粉虱C⁺品系刺探的总持续时间和路径波（C波）总持续时间显著高于C^-品系（P<0.05）,C⁺品系第一次E波后非刺探时间显著低于C^-品系（P＜0.05）;在韧皮部阶段,两个品系分泌唾液（E1波）和吸食汁液（E2波）的相关参数无显著差异（P＞0.05）,6 h能到达韧皮部阶段的烟粉虱比例也无显著差异（P＞0.05）。在取食番茄的非韧皮部阶段,烟粉虱C⁺品系的刺探总次数和第一次E波前的刺探次数均显著高于C^-品系（P＜0.05）,C⁺品系从第一次刺探到第一次持续取食的时间显著长于C^-品系（P＜0.05）,但刺探的平均持续时间显著短于C^-品系;在韧皮部阶段,两个品系在与分泌唾液和吸食汁液相关的参数均无显著差异（P＞0.05）,6 h能到达韧皮部阶段的烟粉虱比例也无显著差异（P＞0.05）。总体上,烟粉虱C⁺品系和C^-品系在韧皮部的取食行为参数无显著差异;在非韧皮部C⁺品系较C^-品系具有更长的刺探时间和更多的刺探总次数。【结论】烟粉虱C⁺品系和C^-品系在寄主植物韧皮部的取食行为没有差异,在非韧皮部存在显著差异。在非韧皮部的取食行为差异可能与其适合度差异有关。     

斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h与小分子化合物的结合特征

【目的】克隆斑翅果蝇（Drosophila suzukii）气味结合蛋白56h（odorant binding protein 56h,OBP56h）基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L ^-1 Tris-HCl（pH 7.4）稀释至终浓度2 μmol·L ^-1,配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L ^-1,以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐（4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt,bis-ANS）荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。 【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L ^-1IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568 μmol·L ^-1,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93 μmol·L ^-1,柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32 μmol·L ^-1,草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37 μmol·L ^-1。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

苦豆子生物碱对番茄生长及果实品质的影响

【目的】通过测定植物源农药苦豆子生物碱对番茄生长发育及果实品质的影响,探讨苦豆子生物碱对番茄形态及发育的调控效应,全面了解苦豆子生物碱的生物学效应,为其科学合理使用提供依据。【方法】以番茄为供试植物,阿维菌素为对照药剂,测定苦豆子生物碱不同浓度（333.0、166.5和111.0 mg·L^-1）处理对番茄植株形态、果实产量及品质指标的影响。采用盆栽试验测定苦豆子生物碱对番茄幼苗株高、茎粗、叶片总数、最大叶长和宽及叶绿素含量的影响;采用田间小区试验测定苦豆子生物碱对番茄产量、可溶性糖含量、可滴定酸含量、维生素C含量和硝酸盐含量的影响。【结果】苦豆子生物碱对番茄植株生长及果实品质具有明显的调控作用。盆栽试验结果表明,166.5 mg·L^-1处理对番茄幼苗的刺激生长作用最为明显,与空白对照（清水处理）相比,每次施药后第7天,番茄的株高相对生长速率分别增加55.07%、103.03%和60.60%,茎粗净增长量分别增加31.54%、225.80%和185.45%,但叶片形态无明显变化;在333.0和166.5 mg·L^-1浓度下,与空白对照相比,苦豆子生物碱处理后可使叶片叶绿素含量分别升高6.16%-13.79%和6.89%-17.12%,而111.0 mg·L^-1浓度处理的番茄叶绿素含量较空白对照却下降0.60%-9.40%。田间小区产量测定结果表明,333.0、166.5和111.0 mg·L^-1的苦豆子生物碱处理后,与空白对照相比,番茄第一穗果实平均单果重分别增加13.07%、20.92%和9.15%,第二穗果实平均单果重与空白对照均无显著差异,第三穗果实平均单果重分别增加12.23%、20.86%和17.27%;且166.5 mg?L^-1浓度下,番茄前期产量较对照增加16.48%,而333.0和111.0 mg·L^-1处理下,产量无显著增加。田间小区试验果实品质测定结果表明,在浓度为333.0和111.0 mg·L^-1的苦豆子生物碱处理下,与空白对照相比,可溶性糖含量平均值明显下降,而166.5 mg·L^-1处理下可溶性糖含量与对照无显著差异;在333.0、166.5和111.0 mg·L^-1浓度下,可滴定酸含量平均值分别较空白对照增加37.01%、23.88%和27.16%;333.0、166.5 mg·L^-1浓度的苦豆子生物碱处理后,与空白对照相比,番茄第一穗果实的维生素C含量分别下降28.06%和21.91%,第二穗分别下降27.37%和26.34%,而第三穗分别增加7.28%和7.69%,呈先降低后升高的趋势,而111.0 mg·L^-1浓度下,第一、二穗果实维生素C含量较空白对照显著下降,第三穗果实维生素C含量与空白对照无显著差异;苦豆子生物碱处理后番茄果实中硝酸盐的含量与空白对照相比显著增加,且浓度越高,硝酸盐积累越多,但仍远远低于中国蔬菜硝酸盐允许量。【结论】在田间常用浓度(166.5 mg·L^-1) 下,苦豆子生物碱能够在番茄营养期促进生长,生殖期促进果实增产,对果实品质无不利影响,作为一类新型、安全的植物源农药,具有较好的开发应用前景。     

中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。