孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1( SBD-1) mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10~(-8) mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测 SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导 SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C (PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A (PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10~(-8)mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h, SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的 SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后 SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中 SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。     

17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2(SBD-2)表达的可能信号通路研究

【目的】探讨17β-雌二醇(E2)上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2表达的可能信号通路。【方法】分离培养绵羊输卵管上皮细胞,将第2代输卵管上皮细胞分为E2(10-8 mol/L)组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-7mol/L)组、PKA阻断剂KT-5720(1μmol/L)组、PKC阻断剂H-7(50μmol/L)组、NF-κB阻断剂PDTC(50μmol/L)组及空白对照(Control)组,在不同阻断剂组加入各自阻断剂干预绵羊输卵管上皮细胞1h后,在各阻断剂组和E2组中再加入10-8 mol/L 17β-雌二醇培养6h,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组SBD-2mRNA表达水平的变化。【结果】10-8 mol/L 17β-雌二醇可显著上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2mRNA的表达(P<0.05);雌激素受体拮抗剂ICI182780、NF-κΒ阻断剂PDTC、PKC阻断剂H-7均可阻断17β-雌二醇对SBD-2的上调作用,PKA阻断剂KT-5720对17β-雌二醇介导的SBD-2上调无明显影响。【结论】17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2的表达由雌激素核受体、NF-κΒ、PKC信号转导通路所介导,而PKA不参与17β-雌二醇对SBD-2的上调作用。     

绵羊IL-6启动子的克隆及pIL6-TLR4载体构建

为生产抗病转基因绵羊,并确保转基因羊的安全性。克隆绵羊IL-6启动子序列,以IL-6为启动子构建TLR4过表达载体,转染绵羊成纤维细胞验证功能。用1μg·L-1的LPS刺激转染后的绵羊成纤维细胞,利用q PCR技术和ELISA方法检测受LPS刺激后的成纤维细胞TLR4 m RNA表达量和TLR4蛋白表达量。结果表明,转染后的TLR4 m RNA表达量在2、4、24、48 h显著高于对照组(P0.05),其中2、4、24 h极显著高于对照组(P0.01),TLR4蛋白表达量始终高于对照组。说明p IL6-TLR4过表达载体构建成功。     

褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在m RNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h,当细胞密度达60%—70%时,使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次,然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度(0、10、20、30、50 mmol·L-1)的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h,观察和统计INS-1细胞的形态学变化。利用Easy Pure?RNA Kit提取INS-1细胞的总RNA,核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度,其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量,Trans Script One-Step g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录合成c DNA。利用Primer Premier5.0引物设计软件,参考Gen Bank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα引物的设计。应用q RT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCαm RNA水平的变化。【结果】用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后,观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显,而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大,但突触增长却不明显;培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中,Insulin1 m RNA水平呈现先升后降的趋势,Gαi1 m RNA水平则呈现先降后升的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组,Insulin1 m RNA水平显著增加(P0.05),Gαi1 m RNA水平显著减少(P0.05),而Gαi2和Gαo则无显著变化(P0.05),因而Gαi1表现出与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性;20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L-1葡萄糖处理组相比,20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 m RNA水平显著增高(P0.05),且Insulin1和PKCαm RNA水平显著减少(P0.05),PKA m RNA水平则减少不显著(P0.05)。【结论】褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达,减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生。褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 m RNA水平增高而抑制PKCα的表达,使得Insulin1的表达受到抑制,胰岛素分泌减少,使血糖在夜间得以维持相对恒定。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF及其受体FGFR2表达的影响

[目的]探讨大肠杆菌(Escherichia coli)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)b FGF及其受体FGFR2表达的影响。[方法]取热灭活的0、105、106和108CFU/m L浓度的大肠杆菌作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,分别在作用后6、12、24和48 h,采用荧光定量PCR和Western blot方法检测b FGF和FGFR2的mRNA和蛋白的表达情况。[结果]b FGF mRNA表达与对照组相比随着大肠杆菌浓度的升高而显著上调(P0.01),24 h b FGF表达量最高。BMEC b FGF蛋白表达随着大肠杆菌浓度的增加而上调,24 h表达量达到最高;FGFR2 mRNA相对表达量除6 h组外随大肠杆菌浓度的增加而呈现降低、升高、降低的变化趋势,48 h表达量达到最高。各处理组与对照组相比FGFR2蛋白表达随时间的延长、菌液浓度的增加而上调。[结论]大肠杆菌刺激奶牛乳腺上皮细胞可以明显促进b FGF和FGFR2的表达,具有浓度和时间依赖性。     

外源反-10，顺-12共轭亚油酸对体外培养牛乳腺上皮细胞SREBP-1基因表达和蛋白质合成的影响

 【目的】旨在观察反-10,顺-12,共轭亚油酸（t10c12 CLA）对牛乳腺上皮细胞中甾醇调控元件结合蛋白（SREBP-1）基因的表达和蛋白质加工的影响。【方法】本试验使用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞,使用不同浓度t10c12 CLA处理乳腺上皮细胞后,用油红染色法检测胞质内的脂滴分布,Trizol法提取细胞总RNA,荧光定量PCR法测定相关基因的表达量,试剂盒法提取细胞总蛋白,进行Western blotting。【结果】随t10c12 CLA添加量的增加,细胞质内甘油三酯的含量逐渐降低。与对照组相比,75、112.5和150 μmol•L-1 t10c12 CLA均对胞质内甘油三酯的积累有显著抑制作用（P＜0.05）。t10c12 CLA 的添加对SREBP-1基因和参与SREBP-1蛋白加工调节基因的表达均无显著性影响（P＞0.05）。根据蛋白质电泳结果推测,t10c12 CLA对SREBP-1前体蛋白的合成并无影响,可能对SREBP-1的加工活化产生抑制作用或对其分解产生促进作用。【结论】t10c12 CLA能抑制胞质内甘油三酯的积累,对SREBP-1基因的表达、蛋白质翻译均无影响,可能影响其加工活化过程和活性蛋白的降解过程。     

饲粮添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能与瘤胃发酵的影响

【目的】研究饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对绵羊生长性能和瘤胃发酵的影响,为酿酒酵母和地衣芽孢杆菌在肉羊饲粮中的合理应用提供理论依据。【方法】试验选用48只4月龄、体重相近(22.96±2.00)kg、健康的杜泊×小尾寒羊杂交F_1代公羔,根据饲喂添加剂不同随机分为4组:D(对照组,两种菌均不添加);D1(酿酒酵母,6×10~(10) CFU/kg);D2(地衣芽孢杆菌,2×10~(10) CFU/kg);D3(酿酒酵母6×10~(10) CFU/kg+地衣芽孢杆菌2×10~(10) CFU/kg),每组12只羊,试验期共75 d,前15 d为适应期,正饲期60d。试验羊每天分别于08:00和18:00进行饲喂,自由采食和饮水。正饲期内每天准确称量记录每只试验羊的喂料量和剩料量,并在第1、30、60天晨饲前对试验羊进行称重,计算平均日采食量、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)。试验结束当天08:00正常饲喂试验羊,3 h后采集瘤胃液,测定发酵参数、消化酶活性以及功能微生物。【结果】1)饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对试验羊的初始体重和终末体重及平均采食量的影响均不显著(P0.05),D3组的ADG显著高于D组(P0.05),D3组的F/G显著低于D组(P0.05),D1和D2组的F/G差异不显著(P0.05);2)饲粮中添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对瘤胃液pH、丁酸浓度及乙丙比的影响均不显著(P0.05),D3组的NH3-N浓度显著低于D组(P0.05),TVFA和丙酸浓度显著高于D组(P0.05),且D3组与D1和D2组均差异不显著(P0.05),D3和D2组的乙酸浓度显著高于D1与D组(P0.05);3)D3组的β-葡萄糖苷酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶及淀粉酶活性均显著高于其他3组(P0.05)。D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶及淀粉酶活性与D组无显著差异(P0.05)。D3组蛋白酶活性显著高于D和D2组(P0.05),与D1组差异不显著(P0.05),D1和D2组的β-葡萄糖苷酶、果胶酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶及淀粉酶活性均差异不显著(P0.05);4)添加酿酒酵母和地衣芽孢杆菌对黄色瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和原虫数量的影响不显著(P0.05),D3组的溶纤维丁酸弧菌数显著高于其他3组(P0.05),白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌显著高于D组(P0.05),但与D1和D2组差异不显著(P0.05)。与对照组相比,试验组产甲烷菌数量显著降低(P0.05),其中D3组最低。【结论】饲粮中添加6×10~(10)CFU/kg酿酒酵母和2×10~(10)CFU/kg地衣芽孢杆菌均会对绵羊瘤胃发酵产生积极影响,提高了瘤胃消化酶的活性,增加了瘤胃有益菌的数量,且二者组合饲喂效果更加显著。     

嗜水气单胞菌感染对黄鳝Moronecidin基因表达的影响

为研究嗜水气单胞菌对黄鳝Moronecidin基因表达的影响,用不同浓度嗜水气单胞菌菌液感染健康黄鳝,采用荧光定量PCR方法分别检测染菌黄鳝脾脏、肾脏和肌肉中Moronecidin基因在感染后12、24、48 h的表达量。结果表明,Moronecidin基因在健康黄鳝的上述3种组织器官中都有表达;腹腔注射嗜水气单胞菌后,该基因的表达量明显升高。随着感染时间的延长,3种组织器官中Moronecidin基因的表达量在处理1(菌液浓度为1亿CFU/mL)均呈现逐渐升高的趋势,处理2(菌液浓度为2亿CFU/mL)脾脏中Moronecidin基因的表达量随处理时间延长而逐渐升高,而肾脏和肌肉中的表达量则呈先升高后降低的趋势;处理3(4亿CFU/mL)Moronecidin基因的表达量在3种组织器官中均逐渐降低。     

R-工程菌表达产物酯酶 B1的固定化及其降解特性

将抗性库蚊的解毒酶基因克隆到大肠杆菌中,得到R-工程菌,该工程菌的表达产物酯酶B1能高效降解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、菊酯等4大类农药。本研究将重组质粒pR L-B1转入大肠杆菌D H5α,以5%的接种量转接到LB液体培养基中,37℃振荡培养13h。超声波破碎工程菌,20%～80%的硫酸铵沉淀粗提后,采用海藻酸钙将R-工程菌表达产物酯酶B1进行固定化,并测定了固定化酶对其特异性底物α-乙酸萘酯的降解特性。结果表明,酶的最佳固定化浓度为0.15g·L-1,最佳固定化时间为12h,固定化酶最佳反应pH为7.0～7.5,最适温度为40℃,固定化酶显示出很高的热稳定性和重复使用稳定性,在常温下其半衰期为12d,利用双倒数法确定固定化酶的Km为1.8×10-3m m ol·L-1,Vm ax为1.45×104U·g-1,固定化酶的K m是液态酶(1.35×10-3m m ol·L-1)的1.33倍,V m ax只有液态酶(2.7×104U·m L-1)的近1/2。利用气相色谱测得其对有机磷农药对硫磷(1605)的降解率在30m in内达53.8%。     

灵芝菌糠悬浊液培养粉状毕赤酵母研究

通过混合因子设计,以粉状毕赤酵母最大生物量为参照,比较了在以灵芝菌糠悬浊液为主要成分的液体培养基中,菌糠浓度、菌糠处理方式、玉米粉添加量三者对粉状毕赤酵母生长的影响,初步考察了经膨化处理的菌糠和未经处理的菌糠之间的区别,得到了经优化的灵芝菌糠悬浊液培养基,其最优配方为膨化灵芝菌糠0.100 g·m L-1,玉米粉0.010 g·m L-1,经由52 h培养后,粉状毕赤酵母的最大生物量为4.527×1010 CFU·m L-1。     

牛支原体等温扩增冻干试剂盒研究

【目的】牛支原体(Mycoplasma bovis)是导致牛多种疾病综合征的病原体之一,在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况,迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞,获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后,获得质粒浓度为10~4拷贝/μL的溶液,作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液(主成份为SYBR Green I和HNB),分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术的基础上配制等温扩增试剂,并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂,每种保护剂分别选用3种不同的浓度,共设计27种保护剂组方,通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂,放到冻干机中测定共晶点,并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定,筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液,组装成试剂盒。利用6个浓度梯度(10~0-10~5个拷贝)重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性,利用浓度为10~4 CCU·mL~(-1)的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10~8CCU·mL~(-1)的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10~8CFU·mL~(-1)的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌,检测试剂盒的特异性。另外,将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存,检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影响等温扩增反应,在此基础上优选的冻干保护剂配方为5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白,等温扩增试剂共晶点为-16℃,一次干燥的升温时间3h,一次干燥时间6h,二次干燥时间4 h。组装后的试剂盒最低可检测到10个拷贝数的重组质粒,检验PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原体均为阳性,检验牛鼻支原体、无乳支原体、多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌均为阴性。试剂盒在20℃保存6个月、37℃保存10 d后,敏感性仍为10个拷贝数,与第0天相同,推测4℃保存有效期为24个月左右。【结论】笔者研制的等温扩增冻干试剂盒敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷,适合基层兽医现场检测使用。     

EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用

【目的】探明表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体（EGFR）在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态,并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢,捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）,进行体外成熟培养;分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态;牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·mL^-1 EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib,比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs 的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞,卵母细胞表达较弱。100 ng·mL^-1 EGF可以显著提高COCs成熟率（73.45±2.09）%及其受精后的卵裂率（59.46±1.41）%和囊胚率（26.23±1.08）%;对照组中（0 EGF）COCs成熟率为(54.16±3.25)%,卵裂率为 (48.33±1.93)%,囊胚率为(15.34±0.43)%;EGF浓度为50 ng·mL^-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·mL^-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达,在50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相对表达量分别仅为对照组（0 EGF）的0.83±0.12,0.21±0.02,0.27±0.03倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Bax基因表达量最低,而Gefitinib作用后可以显著促进成熟COCs中Bax基因的表达,其相对表达量为对照组的4.24±0.10倍;EGF在COCs成熟过程中可以显著促进抗凋亡基因Baxi的表达,其相对表达量在EGF浓度为50、100、200 ng·mL^-1EGF分别为对照组的2.18±0.12、7.06±0.59和6.73±0.31倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Baxi基因表达量最高,而Gefitinib作用后可以显著降低成熟COCs中Baxi基因的表达,其相对表达量为对照组的0.32±0.04倍。【结论】EGF和EGFR作为牦牛COCs体外成熟过程中重要的自分泌因子,且外源的EGF可以显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率,最佳作用浓度为100 ng·mL^-1,其作用机制可能与调控凋亡相关基因Bax和Baxi表达有关。     

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL~(-1)的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】(1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好。(2)空白对照组、1、5及10μg·mL~(-1) MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL~(-1) MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL~(-1)MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化。(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P0.05)。【结论】成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL~(-1)以下。这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响。即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状。     

Research on Yucca schidigera extract feeding on the rumen ecology, protozoal populations and serum chemistries of sheep

In a completely randomized block design experiment, 16 ruminally cannulated male sheep with body weights of (40 ± 2.1) kg were fed twice daily (8:00 and 16:00) with concentrate and forage (50:50 on dry matter (DM) basis). Dietary treatments were supplemented with intraruminal doses of powdered Yucca schidigera extract (YSE) at the levels of 0 (control), 100, 200 and 300 mg · kg⁻¹. On days of 15, 16 and 17 after feeding, ruminal content was sampled at 0, 2, 4, 6 and 8 h after dosing (8:00), and blood samples were collected at the end of experiment (the days 18 and 19 after feeding). Results showed that the treatment groups’ acidity was not affected (P = 0.13) by YSE. Comparing to the control, the ruminal propionate concentration was increased by YSE addition in a dose-dependent manner by up to 29.8% (P < 0.05), and the acetic concentration was decreased by up to 17.5% (P < 0.05). The ruminal ammonia concentration 2 hours after feeding was higher (P < 0.05) in sheep fed without YSE (increased by 17.57 mg· 100 mL⁻¹) than those fed with YSE at 200 mg · kg⁻¹ (6.77 mg · 100 mL⁻¹ increase in NH₃) and at 300 mg · kg⁻¹ (6.50 mg· 100 mL⁻¹ increase in NH₃). Protozoal populations in the rumen were lower (P < 0.05) with the YSE feeding dose at 300 mg · kg⁻¹ than the control. The serum chemistries were not different among treatments (P > 0.05) and were within the normal physiological ranges for sheep 19 days after feeding. The study indicated that 200 mg· kg⁻¹ and 300 mg· kg⁻¹ YSE groups had particular suppressing effects on ruminal ammonia concentration, ammonia-N concentrations and protozoal populations. The effect of YSE on ruminal fermentation could be attributed to the selective inhibitory effect on rumen microbial species. High level (300 mg · kg⁻¹) YSE as feed additives resulted no negative impact on sheep in our tests.     

The Effect of Yucca schidigera Extract on Ruminal Fermentation and Parameters Traits in Sheep

In a completely randomized block design experiment, 16 ruminally cannulated sheep (40 ± 2.1 kg)fed a 50% concentrate 50% forage diet (DM basis) were given intraruminal doses of powdered Yucca schidigera extract (YSE). Doses of 0 (control), 100, 200, or 300 mg kg-1 diet were given at 8 p.m. and 4 a.m. On 15, 16, and 17 d of the experimental period, ruminal contents were sampled 0, 2, 4, 6, and 8 h after dosing, and blood samples were collected at the end of the experiment (18th and 19th d). Acidity was not affected (P＞0.05) by the addition of YSE. Compared with the control, ruminal propionate concentration was increased by 29.4 and 29.8% (P＞0.05) and the acetic acid concentration was decreased by 15.1 and 19.8% (P＞0.05) at 4 and 6 h after YSE (300 mg kg-1) dosing, respectively. Ruminal ammonia concentration in the first 2 h after feeding was higher (P＜0.05) in the sheep that did not receive YSE (increased by 17.57 mg 100 mL-1) than in those that received 200 mg kg-1 (increased by 6.77 mg 100 mL-1) or 300 mg kg-1 (increased by 6.50 mg 100 mL-1) YSE. Protozoan populations in the rumen were lower (P ＜ 0.05) in the animals that received 300 mg kg-1 of YSE compared with the control. All serum parameters of the four groups were in the normal range and were similar among the treatment groups (P＞0.05), after being fed for 19 d with different doses of YSE. The effect of YSE on ruminal ammonia concentration likely resulted from a decreased concentration of protozoan populations and, presumably, from ammonia binding by YSE.     

不同干燥方式对蓝莓叶中酚类物质及其抗氧化活性的影响

【目的】探讨对蓝莓叶酚类物质含量及抗氧化活性的影响,为蓝莓叶的综合开发利用提供参考。【方法】以蓝莓叶为试验材料,设置不同干燥方式处理分别采用福林酚和比色法、亚硝酸盐比色法及高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测各样品的总酚、总黄酮、绿原酸和芦丁含量,采用亚铁还原力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）、DPPH和ABTS⁺自由基清除法测定各样品的抗氧化能力,并分析样品酚类物质含量与抗氧化活性的关系。【结果】4种干燥方式对蓝莓叶中总酚、总黄酮含量及多酚类组份均有不同程度的影响。其中,真空冷冻干燥蓝莓叶中酚类物质含量最高,总酚（55.7 mg GAE·g^-1 DW）、总黄酮（104.8 mg RE·g^-1 DW）两者含量均为微波干燥方式的1.2倍左右,真空和热风干燥方式的3倍左右;多酚单体绿原酸（38.3 mg·g^-1）、芦丁（10.2 mg·g^-1）两者含量是微波干燥方式的1.5倍左右,热风和真空干燥方式的2-6倍。不同干燥方式对蓝莓叶的抗氧化活性影响显著（P＜0.05）。其中,真空冷冻干燥样品的抗氧化能力最强,DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为54.8 µg·mL^-1和183.9µg·mL^-1,亚铁还原能力FRAP值达到6.0,抗氧化能力略高于微波干燥法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为61.8 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值4.0）。微波干燥法样品的抗氧化能力显著高于热风干燥（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.6 µg·mL^-1和575.1 µg·mL^-1,FRAP值1.7）和真空干燥方法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.1 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值1.8）(P＜0.05)。热风和真空干燥样品间抗氧化活性没有明显差异(P＞0.05)。相关性分析表明,除芦丁外,其他酚类物质含量与其抗氧化活性均存在极显著相关(P＜0.01)。【结论】真空冷冻干燥能较好地保留蓝莓叶中的多酚类物质,且具备较强的抗氧化能力和还原能力;微波干燥的效果略低于真空冷冻干燥,生产上可根据样品处理量的大小和具体情况选择干燥方式。     

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg~(-1)体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P0.05),其他参数差异均不显著(P0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P0.05)健康鸭体内的C_(max),其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg~(-1)体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

黄绿绿僵菌悬乳剂与低剂量阿维菌素对Q型烟粉虱的联合防治作用

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）是重要的入侵农业害虫,已对众多常规杀虫剂产生了高度抗性。论文针对烟粉虱的高效治理问题,通过室内和田间联合应用昆虫病原真菌与化学农药,评价其是否对烟粉虱防治具有协同增效作用,为烟粉虱的有效防控提供新的途径。【方法】在前期试验已经筛选到一株对Q型烟粉虱毒力较高的黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride）菌株Mf96基础上,先于实验室条件下采用喷雾法,在3个浓度梯度（1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶个孢子/mL）的黄绿绿僵菌（Mf96）分生孢子悬乳剂中添加1.8%阿维菌素WP,分别配制成含0、15、30、45和60 µg·mL^-1剂量的1.8%阿维菌素WP溶液,并喷到Q型烟粉虱2龄若虫体表,检测其死亡率。在体视显微镜下记录单位面积内的孢子沉积数量。田间试验中,分别将黄绿绿僵菌Mf96菌株悬乳剂（1.0×10⁸个孢子/mL）和1.8%阿维菌素WP（60 µg·mL^-1）单用和混用后喷施于NC95烟草上,评价其对烟粉虱的防治效果。【结果】实验室条件下,Mf96菌株悬乳剂从第4 天到第8 天对“Q型”烟粉虱2龄若虫的LC₅₀从1 376降至183个孢子/mm²。Mf96菌株与阿维菌素（60 µg·mL^-1）混合作用7 d后,真菌LC₅₀从378降至46个孢子/mm²。低剂量的阿维菌素对黄绿绿僵菌Mf96菌株的分生孢子和菌丝生长没有影响。不同浓度黄绿绿僵菌（低、中、高）孢子悬乳剂分别与不同浓度阿维菌素（0、15、30、45 和 60 µg·mL^-1）复配处理后,Q型烟粉虱2龄若虫有不同僵虫率,其中以阿维菌素30 µg·mL^-1与黄绿绿僵菌高浓度悬乳剂复配处理Q型烟粉虱2龄若虫产生的僵虫率最高,达86.8%。对照（悬乳剂基础配方）和单独喷施阿维菌素处理中未见到僵虫。田间喷施真菌孢子悬乳剂、药剂和菌药混剂后5 d和10 d,菌药混用的Q型烟粉虱若虫虫口减退率均最高,分别为53.6%和85.7%;5个随机抽查时间得到校正防效变化趋势与虫口减退率趋势一致,25 d菌药混用的校正防效在所有处理中最高,达88.9%;5个随机抽查时间得到的对照组虫口减退率均为负值。【结论】黄绿绿僵菌Mf96菌株与阿维菌素联合在实验室和田间防治Q型烟粉虱均具有协同增效作用。因此,利用黄绿绿僵菌Mf96分生孢子悬乳剂与低剂量1.8%阿维菌素WP联合防治Q型烟粉虱是一项新的有效措施。