短时高温暴露对褐飞虱存活和生殖特性的影响

【目的】明确短时高温暴露对褐飞虱成虫存活和生殖特性的影响,为褐飞虱种群发生预测及防治提供理论依据。【方法】采集初羽化24 h内的褐飞虱成虫,辨别雌、雄后放入平底玻璃管内,每管5对,置于水浴循环仪中进行高温暴露处理,设置6个靶标温度,分别为33、35、37、39、39.5和40℃,误差范围0.02℃。高温处理时以25℃为起点温度,然后以0.1℃/min的速度上升至靶标温度,待靶标温度恒定后,在靶标温度下处理2 h。处理结束后,将褐飞虱转移到25℃的人工培养箱中,1 h后观察记录其存活情况,以未经过高温处理的褐飞虱成虫为对照。随后研究其存活率、产卵量及后代存活能力是否发生变化。【结果】33-37℃对褐飞虱雌、雄虫的存活率均无显著影响;而39-40℃下暴露2 h,雌、雄虫的存活率显著下降,其中39.5℃下暴露2 h,雌、雄虫存活率均低于50%,40℃下暴露2 h,雌、雄虫存活率仅为4.5%-6.7%,且成虫存活时间不足24 h;不同高温暴露2 h后,褐飞虱雄成虫逐日存活率曲线坡度较雌成虫陡;在35-39.5℃范围内暴露2 h,褐飞虱的产卵前期有所延长,尤其在39.5℃下暴露2 h,每头褐飞虱雌虫的平均产卵前期达6.3 d,与对照（25℃）的产卵前期3.5 d达到极显著差异水平（P＜0.01）;在35和39℃暴露2 h,产卵前期显著延长,分别达到4.4和4.4 d（P＜0.05）;高温暴露对褐飞虱雌成虫产卵量也有明显的影响,33、35、37、39及39.5℃分别暴露2 h,每雌产卵量显著从25℃的365.5粒下降至165.4、194.6、146.7、301.6和234.7粒（P＜0.05）;高温暴露对褐飞虱后代孵化率和性比均无显著影响,但对其后代总存活率有着显著的影响,随着温度上升,F₁代若虫总存活率由对照（25℃）的80.4%下降至61.8%-75.5%;褐飞虱成虫在33-39.5℃高温下暴露2 h,其F₁代若虫总存活率比对照均下降,而除35℃（75.5%）外,其他温度暴露后,均与对照存在显著差异（P＜0.05）,40℃下褐飞虱停止产卵活动。此外,高温暴露还能使褐飞虱的产卵节律和孵化节律发生变化,经39.5℃高温暴露2 h后,较33、35、37和39℃高温处理及对照的产卵高峰期和后代的孵化高峰期推迟。【结论】在39-40℃高温暴露下,褐飞虱成虫存活及产卵量和后代总存活能力显著下降,39℃及以上高温对褐飞虱存活与生殖具有一定的威胁。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

不同虫态的褐稻虱对杀虫剂的毒力及毒理研究

采用点滴法测定褐稻虱各虫态之间对杀虫剂的敏感性差异，结果表明，长翅型雌成虫对叶蝉散等５种杀虫剂的抗药力是５龄若虫抗药力的１．０８－４．０９倍，而短翅型雌成虫对叶蝉散等６种杀虫剂的抗药力是长翅型雌成虫抗药力的１．０８－２．２５倍，其抗药力的大小与害虫体内乙酰胆碱酯酶（靶标酶）和羧酸酯酶（降解酶）活力大小密切相关，其大小顺序为，短翅型雌成虫〉长翅型雌成虫〉长翅型雄成虫〉５龄若虫，而田间褐稻虱对叶蝉散抗     

近零磁场下干扰磁响应关键基因对褐飞虱寿命的影响

【目的】 隐花色素（cryptochrome, Cry）和铁硫簇蛋白IscA（iron-sulfur cluster assembly,即MagR）是生物体内潜在的磁受体蛋白,本研究通过RNA干扰（RNAi）技术,分别敲减褐飞虱（Nilaparvata lugens）体内的磁响应关键基因NlCry1、NlCry2和NlMagR,旨在探明近零磁场（near-zero magnetic field,NZMF）环境下,以上3种基因在褐飞虱寿命调节过程中的作用,从而间接探讨这3种基因对磁场的响应情况。【方法】 采用RNAi技术,以实验室正常磁场环境下稳定饲养的短翅初羽化褐飞虱雌雄成虫为材料,通过向其体内注射双链RNA（dsRNA）分别抑制磁响应关键基因NlCry1、NlCry2和NlMagR,随后立即分别放入正常磁场（geomagnetic field,GMF）和近零磁场中,于每日相同时间观察记录试虫寿命。同时于注射后的1、2和3 d通过RNAiso Plus法提取GMF中褐飞虱雌成虫总RNA,反转录合成第一链DNA,后采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测该基因的表达情况,以确定基因干扰效率。【结果】 注射dsNlCry1后,褐飞虱雌雄成虫寿命在近零磁场和正常磁场间均无显著差异。注射dsNlCry2后,近零磁场中褐飞虱雌雄成虫寿命比正常磁场分别显著延长27.78%和50.04%;此外,与注射dsGFP处理相比,正常磁场下注射dsNlCry2的雌成虫寿命缩短,而近零磁场下注射dsNlCry2的雌成虫寿命延长,但二者差异均不显著;近零磁场和正常磁场下注射dsNlCry2的雄成虫寿命均缩短（25.41%和10.73%）,且正常磁场下差异显著。近零磁场中,注射dsNlMagR的雌成虫寿命较注射dsGFP的寿命显著缩短了16.48%,而雄成虫寿命在磁场间、干扰处理间的差异均不显著。【结论】 磁场变化下褐飞虱雌雄成虫体内3种磁响应关键基因对其寿命的调节功能存在差异。其中,NlCry2对磁场变化存在敏感响应,表现为敲减该基因与磁场变化的互作显著地影响雌雄成虫寿命,且表现出“性二型性”;NlMagR也可对磁场变化产生明显响应,但该响应只存在于雌成虫;此外,NlCry1对磁场变化无响应,该基因或与褐飞虱雌雄成虫寿命调节无关。     

环氧虫啶等5种新烟碱类杀虫剂对不同龄期褐飞虱的室内毒力

采用浸苗法,调查环氧虫啶等5种新烟碱类杀虫剂对室内不同龄期褐飞虱毒力,结果显示:5种新烟碱类化合物对褐飞虱成虫毒力水平最高,其余依次为5龄若虫、1龄若虫和2～4龄若虫.如吡虫啉对1～5龄若虫、雌虫和雄虫的LC50分别为15.61、23.76、22.92、21.64、15.31、8.04、6.72 mg/L.环氧虫啶对褐飞虱1、3、5龄若虫和雄虫毒力水平略好于噻虫嗪和烯啶虫胺,但差异不显著.环氧虫啶、噻虫嗪和烯啶虫胺对2、4龄若虫和雌虫毒力相当,但要显著好于噻虫嗪和烯啶虫胺.以1龄若虫为例,吡虫啉、哌虫啶、环氧虫啶、噻虫嗪和烯啶虫胺LC50分别为15.61、16.14、2.78、3.85、3.18 mg/L.根据以上结果建议环氧虫啶可作为轮换药剂,与噻虫嗪和烯啶虫胺等常用新烟类杀虫剂轮换使用,用于田间褐飞虱防控.     

灰飞虱鞘氨醇激酶时空表达分析及其对杀虫剂胁迫的响应

【目的】明确灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SK)的分子特征,研究SK在携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)与健康灰飞虱两个种群的时空表达及其对杀虫剂胁迫的响应。【方法】利用PCR技术克隆灰飞虱SK(LsSK)基因序列;使用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析LsSK在带毒种群与健康种群灰飞虱1—5龄若虫及成虫期的表达差异,并检测该基因在雌雄虫头、唾液腺、中肠、马氏管、卵巢和精巢等组织中相对表达量;采用手动微量点滴仪将3种杀虫剂(吡虫啉、噻嗪酮和溴氰菊酯)点滴于灰飞虱4龄若虫中胸背板,确定3种杀虫剂的半致死浓度(LC_50);根据半致死浓度的3种杀虫剂处理试虫后检测LsSK的表达动态;采用注射双链RNA(dsRNA)的方法沉默带毒种群和健康种群4龄若虫体内LsSK后,用半致死浓度的3种杀虫剂处理试虫并分析死亡率。【结果】克隆得到一段长度为1 282 bp的LsSK基因片段(Gen Bank登录号:KT989975)。氨基酸系统进化树显示LsSK与其他半翅目昆虫SK聚在同一支。LsSK氨基酸序列包含SK酶的4个保守区域C1—C4,其中SK激酶的活性位点——DAG活性区域位于C1—C3区域。q RT-PCR结果显示LsSK在带毒种群4龄若虫中表达量最高,3龄次之;健康种群5龄若虫表达量最高,1、4龄次之。且LsSK在带毒种群3、4龄表达量显著高于健康种群同时期若虫(P0.05);带毒成虫LsSK表达量显著高于健康成虫(P0.05)。LsSK在带毒雄成虫各个组织中的表达量均显著高于同种群雌成虫和健康雌雄成虫的各相应组织,且在唾液腺和马氏管的表达量最高,头部次之。用半致死浓度的3种杀虫剂(吡虫啉LC_50为6.5 ng·μL~(-1),噻嗪酮为500 ng·μL~(-1),溴氰菊酯为37.5 ng·μL~(-1))处理带毒和健康种群的4龄若虫后,试虫LsSK含量变化与响应速度均不同。噻嗪酮处理后LsSK水平升高且响应最为迅速,溴氰菊酯处理后LsSK表达水平无变化(P0.05)。用3种杀虫剂处理带毒和健康试虫,其死亡率分析结果表明,两种群注射dsSK组3种杀虫剂处理后死亡率均显著高于两种群注射dsGFP组和不注射组。【结论】克隆了LsSK基因片段且其在带毒灰飞虱4龄若虫中表达量最高。沉默LsSK后,带毒和健康种群灰飞虱在杀虫剂处理后的死亡率均显著上升,表明SK基因有利于灰飞虱抵抗杀虫剂胁迫。     

烯啶虫胺、醚菊酯及其混剂对褐飞虱的毒力测定

【目的】了解烯啶虫胺、醚菊酯单剂及其混剂对褐飞虱3龄若虫的毒力作用,为开发防治褐飞虱的复配制剂提供科学依据。【方法】用稻茎浸渍法测定烯啶虫胺、醚菊酯单剂及其混剂对褐飞虱的毒力效果。【结果】烯啶虫胺、醚菊酯对褐飞虱3龄若虫的LC50分别为0.4922和9.1847mga·i·L^-1,两单剂按有效成分质量比为1∶12和1∶27（烯啶虫胺∶醚菊酯）时,共毒系数分别为249.89和138.15。【结论】烯啶虫胺和醚菊酯按有效成分质量比为1∶12和1∶27（烯啶虫胺∶醚菊酯）时有明显的增效作用。     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

烯啶虫胺、醚菊酯及其混剂对褐飞虱的毒力测定

【目的】了解烯啶虫胺、醚菊酯单剂及其混剂对褐飞虱3龄若虫的毒力作用,为开发防治褐飞虱的复配制剂提供科学依据。【方法】用稻茎浸渍法测定烯啶虫胺、醚菊酯单剂及其混剂对褐飞虱的毒力效果。【结果】烯啶虫胺、醚菊酯对褐飞虱3龄若虫的LC50分别为0.4922和9.1847 mg a·i·L-1,两单剂按有效成分质量比为1∶12和1∶27（烯啶虫胺∶醚菊酯）时,共毒系数分别为249.89和138.15。【结论】烯啶虫胺和醚菊酯按有效成分质量比为1∶12和1∶27（烯啶虫胺∶醚菊酯）时有明显的增效作用。     

水稻褐飞虱若虫和成虫褪黑素含量测定及比较

[目的]明确褪黑素在褐飞虱各发育阶段的含量情况.[方法]通过高效液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS/MS)对1～5龄若虫和两种翅型雌、雄成虫体内褪黑素含量进行测定和比较.[结果]褐飞虱若虫期褪黑素含量在1～2龄若虫时期最低,平均为378.5 pg·g-1.3龄若虫褪黑素含量最高,为856.6 pg·g-1.4龄若虫...     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（Al GRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽(Apolygus lucorum)G蛋白偶联受体激酶2基因(AlGRK2)cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素(20E)对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数(发育历期、若虫体重及成虫羽化率)的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区(RGS,54—175 aa)、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(S-TKc,191—454 aa)、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分(S-TK-X,455—534 aa)和PH结构域(PH,558—655 aa),其中...     

极端高温对西花蓟马存活、繁殖特性及体内海藻糖、山梨醇含量的影响

【目的】西花蓟马（Frankliniella occidentalis）是中国的重要外来入侵和检疫性害虫, 对各地的蔬菜和花卉造成了巨大的经济损失。明确极端高温（45℃）对西花蓟马存活率、繁殖力以及体内海藻糖、山梨醇含量的影响,为西花蓟马的防治提供理论依据。【方法】设置45℃条件下高温热激西花蓟马当代成虫、2龄若虫2 h,经过24 h变温模式22℃（4 h）-25℃（8 h）-28℃（4 h）-25℃（8 h）培养后再进行一次45℃ 2 h的热激处理。研究热激处理后其亲代、F₁代和F₂代的种群参数（亲代各虫态存活率、雌成虫寿命,F₁和F₂代种群数量、存活率、性比）以及2龄若虫和成虫体内海藻糖和山梨醇含量的变化。【结果】45℃ 2 h高温热激两次后,西花蓟马各个虫态的存活率均小于50%,且预蛹和蛹的存活率为0,成虫的存活率最高为41.38%,显著高于其他虫态（1龄若虫存活率为5%,2龄若虫存活率为21.36%）（P＜0.05）;西花蓟马2龄若虫和成虫在45℃高温条件下热激2 h两次后,其亲代雌成虫寿命和繁殖力均明显降低,且F₁代也受到较大影响, F₁代种群数量、存活率、性比（♀﹕♂）显著降低,但F₂代种群有所恢复,另外热激处理西花蓟马成虫的雌成虫寿命及繁殖力在亲代、F₁代中都明显高于热激处理2龄若虫（P＜0.05）;西花蓟马亲代成虫和2龄若虫在45℃热激2 h两次后其体内的海藻糖含量明显降低,并且影响到F₁和F₂代种群体内的海藻糖含量,另外热激处理亲代成虫其体内海藻糖含量低于热激处理亲代2龄若虫的海藻糖含量, 且F₁和F₂代与亲代趋势相同（P＜0.05）;西花蓟马亲代成虫和2龄若虫在45℃热激2 h两次后其体内的山梨醇含量明显升高,热激亲代成虫的山梨醇含量高于热激2龄若虫体内的山梨醇含量,且这种热激处理能够影响到后代种群体内山梨醇的含量,F₁和F₂代体内山梨醇含量的变化趋势与亲代相同（P＜0.05）。【结论】45℃极端高温处理不仅对西花蓟马亲代的生长发育、繁殖和生理生化产生了明显的影响,而且这种影响延续到了子代（F₁、F₂代）的不同发育阶段。同时,西花蓟马对极端高温的应对与其体内的海藻糖、山梨醇的含量具有一定的相关性。     

捕食性天敌叉角厉蝽生长发育、繁殖及各虫态形态特征观察

【目的】明确叉角厉蝽[Eocanthecona furcellata(Wolff)]从卵到成虫发育历期及繁殖能力,比较叉角厉蝽各虫态的主要形态鉴别特征,为叉角厉蝽的扩繁及生防潜能开发提供理论支持。【方法】在室内条件下,以云南元江采集并在室内扩繁6代以上的叉角厉蝽为研究对象,在培养皿中采用单头饲养的方法测定叉角厉蝽生长发育指标(卵孵化率、若虫存活率、卵到成虫的发育历期),在饲养盒中雌雄虫配对共培养测定其成虫繁殖力特征。运用显微照相系统比较叉角厉蝽各虫态的主要形态特征。【结果】叉角厉蝽从卵到成虫的平均发育历期为29.00±1.41 d,卵历期为8.00±0.21 d,若虫期为19.76±0.12 d,1~5龄若虫平均发育历期为3.24~5.38 d,卵孵化率为92.91%,若虫存活率为80.21%,雌、雄成虫的平均寿命分别为35.40±1.96和37.40±2.65 d;叉角厉蝽雌成虫交配后,一生平均产卵次数为4.73±2.01次,最多9次,最少2次,平均产卵前期为7.87±2.75 d,产卵期持续14.33±5.13 d,雌成虫与雄成虫交配单次平均产卵量为59.46±15.77粒,未交配雌成虫单次平均产卵量为29.34±15.31粒且为无效卵,最终无法孵化。叉角厉蝽卵为矮杯形或圆筒形,具卵盖,边缘有10~12根刺状精孔突,有金属光泽;1~5龄若虫体色红黑相间,若虫触角4节。1龄若虫触角第2和第3节末端有明显白色环,喙暗红色,接近体长,无翅芽;2龄若虫头部前段扁平突出,触角节间环变为红色,喙黑色;3龄若虫触角第2和第3节末端红色环明显,喙长为体长的一半;4龄若虫喙长为体长的一半,胸部刻点明显,出现翅芽,并延伸至胸部末端;5龄若虫喙暗红色,短于体长一半,中足和后足胫节中部出现白斑,翅芽延伸至腹部第3节;成虫体色黄褐与黑褐混杂相间,密布刻点,触角5节,喙黄褐色,最后一节黑色,喙长短于体长的一半,前胸背板侧角呈剑叉状突出,雄虫腹部近三角形,雌虫腹部卵圆形。【结论】明确了叉角厉蝽的发育历期和繁殖能力,证实叉角厉蝽无孤雌生殖现象。农业生产中可以喙的颜色、长度及翅芽发育作为叉角厉蝽主要形态鉴别特征。     

家蚕GATA转录因子BmGATA6的克隆、多克隆抗体制备及组织细胞定位

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）GATA转录因子BmGATA6,将其在原核细胞中进行表达,纯化重组蛋白,多次免疫小鼠获得BmGATA6多克隆抗体,为进一步分析BmGATA6在家蚕变态发育中的功能提供抗体条件。【方法】解剖家蚕获得5龄第3天的各组织及4眠至熟蚕整个时期的中肠组织,在液氮中研磨为粉末,利用Trizol法提取RNA,体外反转录得到cDNA。基于家蚕BmGATA6的基因编码序列设计全长特异引物,并以BmActin3作为内参,进行家蚕5龄第3天各组织及4龄眠期至熟蚕期各时期的RT-PCR检测。设计原核表达引物,扩增原核表达片段连接到pET32a载体上,构建原核表达载体,转化至BL21(DE3) Escherichia coil表达菌株。加入IPTG至终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1。在16℃条件下培养20 h和37℃条件下培养5 h分别进行BmGATA6蛋白诱导表达。选取最佳诱导条件进行BmGATA6蛋白的大量诱导,用镍柱亲和层析法纯化家蚕BmGATA6蛋白,经多次免疫昆明小鼠后,最终获得BmGATA6多克隆抗体。利用ELISA法测定鼠抗BmGATA6蛋白多克隆抗体的效价,通过Western blot检测BmGATA6抗体的特异性。以家蚕5龄第6天中肠的石蜡切片作为样本,通过免疫荧光对家蚕中肠组织中的BmGATA6蛋白进行亚细胞定位。【结果】家蚕GATA转录因子BmGATA6的cDNA全长4 011 bp,ORF长为1 974 bp,编码657个氨基酸,包括205 bp的5′非翻译区序列（5′UTR）和1 832 bp的3′非翻译区序列（3′UTR）。该基因位于15号染色体上,基因全长12 326 bp,为多外显子基因,共含有8个外显子和7个内含子,具有2个典型的GATA锌指结构域,分别位于第470-521和531-582氨基酸区域。RT-PCR结果显示BmGATA6在5龄第3天家蚕中肠中显著高量表达,其次在马氏管中有少量表达,而在其他组织中没有检测到BmGATA6的表达。同时RT-PCR结果显示BmGATA6在4龄眠期到熟蚕期的中肠组织中持续高表达。构建BmGATA6 原核表达载体,通过不同温度与IPTG浓度诱导发现,BmGATA6重组蛋白在16℃诱导主要存在于上清中,在37℃诱导主要存在于包涵体中。在0.6 mmol·L^-1的IPTG、16℃下诱导20 h为最佳条件,利用镍柱亲和层析法获得较纯的BmGATA6重组蛋白,并利用纯蛋白多次免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用ELISA法对抗体效价进行了检测,显示BmGATA6抗体效价均高达1﹕128 000。Western blot结果显示BmGATA6抗体能特异地识别家蚕BmGATA6蛋白,其大小约为75 kD,与预测大小相符。免疫荧光结果显示BmGATA6蛋白在家蚕中肠的各类细胞中均有较高表达,且定位于中肠细胞的细胞核中。【结论】成功制备了BmGATA6多克隆抗体,分析了其在中肠组织中的亚细胞定位情况,推测BmGATA6在家蚕中肠的生理变化过程中扮演着重要调控角色,为进一步探索BmGATA6在家蚕中的功能奠定了基础。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

【目的】克隆获得中华蜜蜂(Apis cerana cerana)Acer OBP14基因序列,并对其蛋白结构进行预测,分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异,为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织c DNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得Acer OBP14 c DNA全长序列,并提交至Gen Bank数据库;利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA5.2软件中的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建Acer OBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析Acer OBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中m RNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP14的c DNA序列(Gen Bank登录号为KT24648)。Acer OBP14的开放阅读框(ORF)长度为408 bp,编码135个氨基酸,预测其蛋白分子量为15.08 k D,理论等电点为5.44,有信号肽,无跨膜结构,且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域;存在多个比较明显的疏水区域,可能是脂溶性气味分子的结合位点;含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明,Acer OBP14属于分泌型蛋白,主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。Acer OBP14蛋白具有7个α螺旋,α1—α6属于典型OBPs核心螺旋,α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示,Acer OBP14与西方蜜蜂Amel OBP14的氨基酸序列一致性最高,达到86%;其次是大蜜蜂Ador GOBP56a-like,一致性为55%。系统进化树分析表明,同为蜜蜂属的中华蜜蜂Acer OBP14、西方蜜蜂Amel OBP14、大蜜蜂Ador GOBP56a-like、中华蜜蜂Acer OBP21和小蜜蜂Aflo GOBP56d-like聚为一个分支,切叶蜂属的苜蓿切叶蜂Mrot GOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂Mdem GOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂Ocor OBP3和熊蜂属的Bter GOBP56d-like和Bimp GOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示,Acer OBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高,触角次之,且两者均极显著高于头、腹、足和翅(P0.01);其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织(P0.01),其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看,触角的表达量在1日龄最低,极显著地低于其他日龄(P0.01);5、10日龄逐渐增加,15日龄突然下降,20日龄达到最高,极显著高于其他日龄(P0.01);之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势,5日龄之后大幅下降,之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】Acer OBP14属于Minus-C OBP亚家族,具有PBP-GOBP家族的典型结构;组织表达谱结果暗示,Acer OBP14属普通气味结合蛋白GOBP,在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。     

黄曲条跳甲RCN基因的克隆与表达

【目的】克隆黄曲条跳甲钙离子结合蛋白（reticulocalbin, RCN）,并分析其序列特征和表达谱。【方法】结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲钙离子结合蛋白基因的序列特征、功能及表达谱。【结果】获得的黄曲条跳甲RCN基因的cDNA序列全长为1 197 bp,开放阅读框为984 bp,共编码327个氨基酸残基。其蛋白分子含有5个亮氨酸拉链结构域（EF-hand）,与钙离子结合的模体可能为DX（N/D）X（D/N）XXXXXXE。cDNA序列的系统发育分析表明,黄曲条跳甲的RCN与赤拟谷盗的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,RCN在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位都有表达,具有一定的广谱性,其中在头部和中肠的表达量相对较高;触角中雌虫的相对表达量是雄虫的1.9倍,而在生殖系统中,雄虫的相对表达量是雌虫的2.1倍。【结论】成功鉴定了黄曲条跳甲的一种钙离子结合蛋白基因,初步分析了该基因与钙离子结合的模体序列及在虫体不同部位转录水平的表达情况。