脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制

【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制,以期为完善体外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、原始生殖细胞(primitive germ cells,PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell,SSC),提取细胞总RNA。利用RNA-seq高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序,进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富集,寻找脂代谢相关基因以及信号通路;并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid,RA）以及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化,qRT-PCR（quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化,与RNA-seq结果进行比较分析同时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控,富集到27条脂代谢通路中,包括视黄醇代谢、初级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢通路中ADH5在PGC中特异表达,ALDH1A1在整个发育过程中持续上调,ADH5和ALDH1A1在细胞中参与视黄酸的合成;CYP26b1在整个发育过程中持续上调,参与视黄酸的降解过程;RA体外诱导ESC向SSC方向诱导试验结果表明ADH5、ALDH1A1和CYP26b1家族基因在体外RA诱导过程中变化与体内分化过程一致,RA诱导组产生的SSC样细胞显著高于控制组和Piloty’s Acid+RA组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至18d后SSC细胞表面特异标记基因integrinα6和integrinβ1的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组（BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用,体外利用视黄醇代谢通路终产物RA进行诱导时第2天出现类胚体,第4、6天类胚体逐渐增大,第8天开始裂解,在第10天出现SSC样细胞,而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低SSC样细胞的产生,而在体外孵化过程中视黄醇通路抑制后也能影响SSC细胞的产生。     

诱导多能干细胞体外定向分化为雄性生殖细胞研究进展

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是借助基因导入技术将某些转录因子导入人或动物的体细胞,使体细胞重编程而得到的多能性细胞。iPS细胞来源丰富,研究表明利用不同的载体诱导系统或不同的转录因子组合,多种体细胞都可被重编程为iPS细胞,如成纤维细胞、肝细胞、角质细胞及脐带血细胞等。作为干细胞中新的一员,iPS细胞在克隆形态、基因表达模式、表面标志物、拟胚体形成、畸胎瘤及嵌合体形成（小鼠）、分化能力等方面与胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）非常相似。与胚胎干细胞一样,在特定的诱导条件下,iPS细胞在体外可被诱导分化为多种细胞,如心肌细胞、血细胞、生殖细胞等,进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,iPS细胞也成为细胞治疗及组织器官再生最有前景的种子细胞,在细胞替代性治疗、发病机理研究及新药筛选方面具有潜在价值。雄性不育不仅影响人类正常健康生活,对畜牧业的发展也极为不利。国内外的研究成果表明,给予适当的诱导物及诱导条件,人和小鼠的iPS细胞体外可被诱导分化为原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）、精子细胞及其前体细胞。这些研究不仅避免了胚胎干细胞研究领域存在的取材困难、免疫排斥和伦理道德等问题,还为揭示雄性生殖细胞的发育机制及研究雄性不育提供了较好的研究平台。由人iPS细胞诱导得到的雄性配子可为患者提供自身的雄性配子产生后代,避免了免疫排斥问题,为未来治疗雄性不育带来曙光。iPS细胞体外诱导分化技术对现代畜牧业发展也具有巨大的潜在应用价值,可进行转基因动物的生产。现从不同的诱导剂、不同的培养条件及iPS细胞体外诱导分化优势等方面,对iPS细胞体外定向诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展及应用前景进行综述和展望。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

山羊原始生殖细胞的分离与培养

从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P<0.05)。以3个不同质量浓度LIF的培养液培养山羊原始生殖细胞(PGC)结果表明,在原代培养时,效果差异不显著(P>0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含LIF5ng/mL组差异不显著(P>0.05),LIF1ng/mL组培养效果较差(P<0.05)。     

鸡胚胎原始生殖细胞转染EGFP基因的研究

于鸡胚19期分离生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),用于体外培养和传代扩增;对其第2代PGCs进行组织化学法鉴定,采用3种转染方法以增强型绿色荧光蛋白转染PGCs,并对电穿孔方法转染条件进行优化,荧光显微镜下计数细胞,分析PGCs转染效率,探讨有效的转染方法及其优化条件。结果表明:电穿孔方法可获得较高的转染效率,其最优化条件:电场强度为280 V,时间常数为60μs,质粒浓度为15μg.mL-1,转染后室温静置10 min。     

利用绒山羊原始生殖细胞培养胚胎干细胞的研究

[目的]建立绒山羊胚胎干细胞体系。[方法]采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从20 mm绒山羊胎儿生殖嵴及其周围组织分离克隆出大量原始生殖细胞(PGCS)集落。[结果]这些集落的细胞经过多次传代具有胚胎干细胞(ES)的诸多特征,如鸟巢状结构、AKP染色阳性、具有连续传代能力等。[结论]该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

山羊胚胎原始生殖细胞的分离与培养

选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。     

利用绒山羊原始生殖细胞培养胚胎干细胞的研究(英文)

[目的]建立绒山羊胚胎干细胞体系。[方法]采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从20mm绒山羊胎儿生殖嵴及其周围组织分离克隆出大量原始生殖细胞(PGCS)集落。[结果]这些集落的细胞经过多次传代具有胚胎干细胞(ES)的诸多特征,如鸟巢状结构、AKP染色阳性、具有连续传代能力等。[结论]该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

鸡胚原始生殖细胞生物学特性鉴定及相关基因表达研究

采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5～6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

鱼类原始生殖细胞与鱼类性别分化的关系

在鱼类的性别分化中,原始生殖细胞在雌雄二性中的增殖方式不同,而且在部分鱼类中原始生殖细胞的缺失能导致其发育为单一雄性表型。在此过程中,生殖细胞的特有基因vasa的剪接变体的二态性分布与鱼类原始生殖细胞的分化关系密切。     

鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率

【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法（PAS糖原染色、AKP 活性检测）和免疫学方法（TERT抗体、SSEA-1抗体）对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的mRNA序列（NM_001098852）,利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth siRNAs,并将通用无义序列BLOCK-iT^TM Alexa Fluor® Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照siRNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体 pRNA-U6.1,构建不同的shRNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的siRNA和shRNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义siRNA以及仅带有GFP荧光标记基因的shRNA载体作为阴性对照,检测siRNA和shRNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组siRNA和shRNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因mRNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与siRNA或shRNA载体量的配比,得出siRNA转染最优条件为siRNA﹕LipofectamineTM 2000=50 pmol﹕2 μL; shRNA转染最优条件为shRNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5 μL。在以上最优转染条件下,将试验组siRNA和shRNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在siRNA干涉组中,阴性siRNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组siRNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降（P＜0.05）,但在144 h时表达差异不显著（P＞0.05）。在shRNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著（P＞0.05）;而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降（P＜0.05）。与siRNA干涉试验组相比,shRNA 载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】siRNA与shRNA均能较好抑制目的基因的mRNA表达,不同干涉效果表明采用shRNA 载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。     

生殖细胞早期发生与减数分裂启动调节机制的研究进展

卵巢性生殖疾病发生的主要原因之一是卵子发生过程中减数分裂发生或染色体分离异常。为了更好地进行这些生殖疾病的诊断和治疗,需要充分地了解个体发育的生物学过程中及关键时间点。鉴于此,本文主要阐述了哺乳动物生殖细胞早期发生和减数分裂启动的生理过程,介绍生殖细胞的出现、迁移、性别分化和减数分裂的整个过程。深入了解卵母细胞发生过程将为利用体外发育来源的卵母细胞治疗卵巢性生殖疾病,克服女性不孕、卵巢早衰等重大疾病提供一定的理论支持。     

猪类胚胎生殖细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现“S”型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞,通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。