小麦条锈菌Ⅲ型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因(PsPik1)的功能分析

【目的】克隆小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶基因(Ps Pik1),分析其在小麦条锈菌生长发育与致病过程中的作用。【方法】利用RT-PCR技术克隆Ps Pik1的c DNA序列,采用生物信息学技术分析该基因编码蛋白分子特征并构建进化树;运用实时荧光定量PCR技术,选用小麦条锈菌的延伸因子(elongation factor,EF)作为内参,明确该基因在小麦条锈菌夏孢子阶段和侵染小麦后6、12、18、24、36、48 h以及3、5、7、9、11 d共12个发育时期的表达特征;利用病毒介导的基因沉默技术(BSMV-host-induced gene silencing,BSMV-HIGS),分析沉默Ps Pik1后对小麦条锈菌生长发育及致病性的影响。通过传统酶切连接的方法构建重组载体BSMV:γ:Ps Pik1-as,利用体外转录技术获得BSMVα、β与γ3个组分,在小麦二叶一心期接种BSMV:γ:Ps Pik1-as、BSMV:γ:0-as与BSMV:γ:Ta PDS-as。接种病毒后第10天,在小麦第4叶接种条锈菌CYR32,接菌后24、48、120 h分别取样,以检测Ps Pik1的沉默效率和进行组织学观察。样品经染色处理后,统计分析接菌后48 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌丝分支数、吸器母细胞数与菌丝长度的差异,及120 h沉默植株与对照植株中条锈菌菌落面积的差异。在接菌后12 d观察条锈病发病情况并照相记录。【结果】Ps Pik1开放阅读框(open reading frame,ORF)全长4 485 bp,编码1 494个氨基酸,具有III型磷脂酰肌醇4-羟基激酶典型的脂激酶特有结构域(LKU)、钙神经传感蛋白(NCS1)结合位点、Hom2结构域和PI3K/PI4K超家族激酶结构域。聚类分析表明,Ps Pik1聚于PI4KIIIβ类群,Ps Pik1与柄锈菌属的Pik1亲缘关系较近,与子囊菌Pik1亲缘关系次之,而与动物及植物的PI4KIIIβ亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,Ps Pik1在接种后6、12、18、24 h呈诱导上调表达趋势,分别为夏孢子时期表达量的2.66、7.04、3.42、2.96倍,其中在12 h其表达水平最高。接种后36 h至5 d,Ps Pik1的表达水平开始下降,一直低于夏孢子表达水平,分别为夏孢子表达量的60%、30%、16%、15%。接种后7—11 d,Ps Pik1的表达量开始升高,在接种后11 d恢复至与夏孢子相当的水平。Ps Pik1基因沉默后的组织学观察分析表明,与接种BSMV:γ:0-as(对照)相比,接种BSMV:γ:Ps Pik1-as植株中条锈菌组织分化与生长发育受到了不同程度的影响,表现在接菌后48 h菌丝长度和分支数目明显减小,接菌后120 h菌落面积明显减小。沉默效率检测结果显示,在接菌后24、48、120 h,接种BSMV:γ:Ps Pik1-as植株Ps Pik1的表达水平分别仅为对照植物的49%、49%、69%,表明Ps Pik1的表达明显地受到抑制。【结论】Ps Pik1可能参与了病菌侵染初期的侵染结构分化及寄生关系的建立,在条锈菌致病过程中发挥重要作用。     

腺苷对猪血小板膜上磷脂酰肌醇激酶和磷脂酰肌醇-4-磷酸激酶的抑制作用

用差速离心法分离猪血小板膜，在适当条件下，用［ γ－３２ Ｐ） ＡＴＰ与其保温，观察３２Ｐ掺入磷脂情况。结果表明：（１）无外源性磷脂酰肌醇－４－磷酸（ＰＩＰ）时，３２Ｐ主要掺入ＰＩＰ；补充外源性ＰＩＰ后，３２Ｐ也可掺入磷脂酰肌醇－ ４， ５－二磷酸（ ＰＩＰ２） ９（ ２）腺苷及类似物 ５’－氧－ ５’－脱氧腺苷对３２ Ｐ掺入这两种磷脂均有强烈的抑制作用；（３）这种抑制作用呈剂量—效应关系（ＩＣ５０分别为８０μｍｏｌ／Ｌ和７０μｍｏｌ／ Ｌ），并与ＡＴＰ里竞争性。提示腺苷及类似物５’－氯－５’－脱氧腺苷这种抑制作用可能与其抑制血小板聚集作用有关。     

腺苷对猪血小板膜上磷脂酰肌醇激酶和磷脂酰肌醇—4—磷酸激酶的抑制作用

用差速离心法分离猪血小板膜,在适当条件下,用〔γ—~(32)P〕ATP与其保温,观察P掺入磷脂情况。结果表     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

家蚕磷脂酰肌醇3-激酶(Bmpi3k)基因的克隆及分析

磷脂酰肌醇3-激酶是一种重要的信号传导因子,对细胞生长、调节等生命活动起重要的作用。文章通过对家蚕(Bombyx mori)表达序列标签(EST)搜索及基因组DNA的预测,利用RT-PCR克隆得到家蚕磷脂酰肌醇3-激酶基因的全长cDNA序列,命名为Bmpi3k。序列分析表明,该基因mRNA全长3 368 bp,其开放式阅读框(ORF)大小为3 165 bp,编码产生1055个氨基酸。其预测的蛋白分子量为122.79 kDa,等电点为7.32。通过对BmPI3K蛋白质序列比对分析发现,BmPI3K保守性较高,包含5个PI3K蛋白特有的保守结构域,推测其参与了家蚕的重要生命活动的调节。     

重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110β催化亚基的原核表达

目的：表达人磷脂酰肌醇3－激酶p110β催化亚基。方法：将构建有人磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)p110β催化亚基cDNA的重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达。用磷脂酰肌醇－4、5－二磷酸、[γ-^32P]ATP与重组PI 3－K p110β催化亚基一起保温的方法测定PI 3－K的活性；^32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提、板薄层层析和放射自显影来分析。结果：SDS－PAGE显示表达出－110kD的新蛋白质分子，重组蛋白占菌体总蛋白的比例为15％，大多数重组蛋白以可溶性形成存在。wortmannin是PI3－K特异的抑制剂，wortmannin对重组PI 3－K p110β亚基有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系（2.5-20nmol/L)。结论：重组蛋白是有活性的人PI3－Kp110β催化亚基。     

Tyrphostin AG555对重组人磷脂酰肌醇3-激酶pll0 β催化亚基的影响

磷脂酰肌醇 3 -激酶 (P13 - K)是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应器和涉及信号转导、细胞转化的关键酶。P13 - K根据结构的相似性和底物的特殊性可分为 3种类型 ,其中第一种类型的 P13 - K是由 85 k D(p85 α和 p85 β)调节亚基和 110 k D(p110 α、p110 β和 p110 δ)催化亚     

条锈菌诱导的小麦C3HC4型锌指蛋白基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。     

受条锈菌诱导的小麦丝氨酸苏氨酸激酶基因TaS/TK的克隆与表达

以小麦基因芯片数据获得的1个受条锈病菌诱导上调表达的EST序列为探针,从小麦中克隆抗条锈病相关基因TaS/TK,并对其序列特征、进化关系和表达特征进行分析。结果表明:TaS/TK基因c DNA全长为1 582 bp,包含1 239 bp的ORF、139 bp的5'UTR以及240 bp的3'UTR,编码412个氨基酸,分子量47 120,等电点为5.84,并将其定位于小麦5B染色体;SMART软件分析结果表明TaS/TK仅存在1个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域;经激酶区Blastp比对分析,TaS/TK与其他植物同源性较低,与同源性最高的短柄草仅为59%;qRT-PCR检测结果显示,TaS/TK在小麦茎、叶中均有表达,但在根中低水平表达;TaS/TK在抗病小麦、感病小麦中均受条锈菌诱导表达,但在抗病材料中表达水平明显高于感病材料;同时,TaS/TK受水杨酸诱导上调表达。以上结果表明TaS/TK可能参与小麦SA信号通路中对条锈病菌的抗性反应。     

小麦条锈病菌菌种的纯化与保存方法

通过对田间收集的小麦条锈菌进行分离和鉴定,建立了单孢子堆分离方法,并比较了不同储藏温度下保存不同时间后条锈菌对小麦的致病率,以探索条锈菌的保存条件。结果表明,单孢子堆分离法获得的菌系可满足后续研究;冷冻保存后菌种的致病率均大于93%,明显高于冷藏保存后的致病率,年限越长,差异性越明显,表明冷藏保存只适宜菌种的短期保存,而冷冻保存适宜于长期保存。     

小麦条锈菌致病性及其变异研究进展

小麦条锈病（wheat stripe rust or yellow rust）是一种气传性的低温真菌病害,在所有小麦产区均可暴发流行,造成巨大的产量和经济损失,严重威胁着小麦的安全生产。其病原条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks. & Henn.,Pst）为严格专性寄生真菌,致病性变异频繁,常造成小麦品种抗条锈性“丧失”,引发病害大流行。因而,从20世纪50年代起,条锈菌致病性变异的研究一直备受关注,并已开展了大量的研究工作。本文从小麦品种抗病性丧失、条锈菌致病性变异途径、条锈菌群体遗传、条锈菌基因组和功能基因组以及条锈菌效应蛋白等不同方面概述了近年来取得的重要研究进展,提出了未来条锈病防治上面临的问题和挑战;以期通过准确预测条锈菌优势小种、合理利用和布局抗病基因、利用新策略创制新型持久广谱抗病材料,不断优化和完善小麦条锈病综合治理技术体系,实现小麦条锈病可持续控制。     

四川省阿坝州小麦条锈菌遗传多样性分析

对阿坝及其周边地区条锈病菌生理小种和AFLP多态性进行了研究.49个参试菌株条锈病菌生理小种分为2种类型:水源11致病类群类型和Hybrid46致病类群,分别占44.9 %和55.1 %,其中水-14和CY32为优势小种.CY31仅在黑水县检测到,云南盐津菌株CY32比例显著高于其他采样点.利用E2M3、E4M3、E7M3、E2M4、E6M4、E4M6、E6M7等7个引物组合,对各菌株基因组DNA进行扩增出,共扩增出168条可统计的条带,其中多态性条带为32条,多态率为19.05 %.49个样品AFLP的Dice相似系数范围为:0.4063~1.0,其中阿坝州菌株聚类分析后被分作A、B两组,后者在相似系数0.7814水平上又分为两个亚组.松潘县的菌株中,4个菌株属于A组,9个菌株属于B组第一亚组,6个菌株属于第二亚组.来自黑水县和九寨沟县的菌株均属B组的第二亚组.第二亚组遍及阿坝州各采样点.来自凉山州普格县的菌株与阿坝州的菌株的遗传相似性很低,在相似系数0.73水平时归入C组.但在阿坝和凉山分别个测出1个菌株,与区内其它菌株均不相似,但彼此间相似系数为0.7813;可见四川条锈病菌阿坝群体独立于梁山州群体,但又有一定的联系.来自云南盐津的条锈病菌根据AFLP多态性被划成B组的第三亚组,与普格县菌株相差较大而与阿坝州菌株更相似,其来源尚有待进一步研究.在同一块田中,条锈病菌的组成可以相差很大,遗传相似系数为1.0的菌株一块田内发现两株.松潘青云乡至川主寺沿公路晒场、院坝子上自生麦苗上菌株在不同采样点间病菌也有差别.未发现生理小种和AFLP性之间的关联性.以CY32为例,其AFLP多态性十分明显,菌株分属A、B1、B2、B3等不同类型.表明病菌毒性突变可以在不同遗传背景的菌株中发生,新小种的发生可能不是由1个突变克隆不断繁殖扩大而来.     

基于多样性种植的小麦条锈菌群体结构分析

多样性种植能够有效地控制小麦条锈病。本文通过6对小麦条锈菌生理小种（条中33,条中32,条中31,条中29,条中23和水源型）特异分子标记分析采集自不同种植模式下自然发病的小麦条锈菌生理小种和群体结构。结果表明：川麦107与蚕豆（或者豌豆）间作时单个病斑检出多个小麦条锈菌生理小种的比例略高于川麦107净作,其余种植模式差异不明显。另外,以采集自各小区的小麦条锈菌样品为1个群体,利用POPGENE 1.32分析小麦条锈菌群体间的关系,结果表明：净作靖麦14的3个小区的3个小麦条锈菌群体与净作川麦107的3个小区的3个条锈菌群体分别聚在了2个大的群体中,而且3个小区相同种植模式下的3个群体也几乎聚在一起,说明种植模式可能对小麦条锈菌的群体有一定影响。     

小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中编码分泌蛋白的序列预测

【目的】植物与病原菌互作过程中,涉及许多可以与植物受体蛋白相互识别、引发植物防卫反应的病原菌激发子或其他致病因子,其中多数为分泌蛋白,深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。【方法】通过SignalP v3.0、TMHMM v2.0、TargetP v1.1、Protcomp v6.0 4个软件,对陕西省农业分子生物学重点实验室构建的小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中854条EST序列进行分泌蛋白预测。【结果】得到具有可溶性分泌信号肽的蛋白编码序列33条,占测定序列的3.86%,其中最小长度为196 bp,最大为1 096 bp,分泌信号肽切割位点基本位于15~42个氨基酸,平均为37个氨基酸。【结论】预测得到的分泌蛋白编码序列,可以作为小麦与条锈菌互作过程中的激发子和致病因子备选基因来进一步研究。     

不同栽培模式对小麦条锈菌群体结构的影响

 研究对不同栽培模式（净栽和混栽）下采集的113份感染小麦条锈病的新鲜叶片,从罹病叶片中直接提取罹病组织的DNA,利用我国及云南省的5个小麦条锈菌主要流行小种（条中32,条中29,条中31,条中23和水源类型）特异的分子标记对小麦条锈菌生理小种进行分子检测,明确不同栽培模式对小麦条锈菌群体结构的影响。结果表明,混栽条件下主要小种特异标记的检出率比净栽的低,净栽田块的优势小种特异标记为条中32和条中29,出现频率分别为81.5%和78.5%,而混栽田块的优势小种特异标记为条中29和水源类型,出现频率分别为41.7%和18.8%;混栽田块中41.7%的叶片中含有2个以上小种特异标记,58.3%的叶片中含有1个小种特异标记,而净栽田块中75.0%的叶片中含有2个以上小种特异标记,25.0%的叶片中含有1个小种特异标记。表明小麦品种混栽能有效地减少单个叶片中的小种数,并显著降低小麦条锈菌优势小种的出现频率,前者可能是减少病害严重度的重要原因,而后者则可能对病害的流行产生重要影响。     

小麦条锈菌条中32号及水14致病类型毒性基因分析

利用Flor基因对基因学说原理对条锈菌生理小种条中32号和水14所含的毒性基因进行推导,结果表明,条中32号含有VYr-1、VYr-2、VYr-3、VYr-6、VYr-7、VYr-8、VYr-9、VYr—11、VYr-12、VYr-18、VYr—Su、VYr—C5、VYr—SD、VYr—SpP等毒性基因,水14含有VYr-1、VYr-2、VYr-3、VYr-6、VYr-7、VYr-8、VYr-9、VYr—11、VYr-12、VYr-18、VYr—Su、VYr—C5、VYr—C591、VYr—SD、VYr—SpP等毒性基因。对条中32和水14的毒性基因谱的比较发现,水14含有较条中32号特异的VYr—C591毒性基因,致使近年来抗病品种C591田间抗病性丧失。     

陇南地区小麦条锈菌群体遗传多样性SSR分析

 【目的】甘肃陇南地区是小麦条锈菌最主要和最大的越夏区,本研究的目的是分析该地区的小麦条锈菌自然群体的遗传结构,探索其分子遗传变异规律。【方法】采用TP-M13-SSR 荧光标记技术,对甘肃省陇南地区8个种群409个小麦条锈菌分离株基因组DNA进行SSR标记分析。【结果】陇南地区小麦条锈菌的观察等位基因数（Na）为1.95,有效等位基因数目（Ne）为1.43,Nei's (1973)基因多样性指数（H）为0.27,Shannon 信息指数(I)为0.41。武都、文县和秦城种群遗传多样性较高,徽县、成县和西和种群相对较低。AMOVA分析结果表明,小麦条锈菌群体间和群体内都存在着一定的遗传分化,群体间的遗传变异占总变异的12.5%,群体内遗传变异占87.5%。地区间的基因流Nm =1.83。【结论】陇南地区小麦条锈菌群体遗传多样性很丰富,但地区之间有一定的差异;群体遗传变异主要存在于群体内部,不同地区间存在基因的交流和病原菌的移动。     

中国小麦条锈菌生理小种演化及遗传重组

[目的]探索中国小麦条锈菌主要生理小种毒性演化关系及小种间的亲缘关系,以期寻找生理小种遗传重组的分子证据,进而揭示中国小麦条锈菌生理小种毒性变异机制.[方法]采用鉴别寄主分析毒性法和TP-M13-SSR荧光标记技术,对12年来收集的21个菌系进行毒性鉴定,并对其夏孢子基因组DNA进行SSR标记分析.[结果]毒性分析和SSR分析各将供试菌系聚为4个类群,两者的相关系数为r=0.21.另外,13对SSR引物中有2对引物显示条锈菌生理小种存在重组现象.[结论]中国条锈菌生理小种毒性多样性丰富,但遗传分化较低,条锈菌夏孢子阶段的体细胞遗传重组可能为毒性变异的主要方式之一.