奶牛亚临床酮病血液生化指标消长规律的研究

目的对亚临床酮病奶牛血液生化指标进行检测,研究分析其消长规律。方法取12头血清β-羟丁酸(BHBA)指数水平>1.2mmol L-1的奶牛为观察组,另取12头BHBA血清含量≤1.2mmol L-1的奶牛为参照组,依次在产前2周、1周、1d,产后1d、1周、2周、3周以及4周时对奶牛血液中非酯化脂肪酸(NEFA)、BHBA以及葡萄糖(GLU)浓度指标水平进行检测,并对试验期间各指标动态变化进行分析。结果与参照组相比,观察组奶牛血液中NEFA、BHBA以及GLU指数水平明显更高,组间差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。结论在奶牛亚临床酮病中,血清BHBA指标可作为主要临床检测指标,而NEFA以及GLU指数则可纳入参考数据范畴,应注意对各项指标的监测,做好奶牛酮病的预防工作。     

不同光质条件及NH4+-N、Cu2+浓度对栅藻处理沼液的影响

将筛选所得耐污能力强的栅藻作为研究对象,研究不同光质条件对栅藻处理沼液的影响,并且以实际沼液废水中NH₄⁺-N、Cu²⁺浓度为参照设置不同浓度,分别考察NH₄⁺-N、Cu²⁺对栅藻生长的影响。结果表明：在白光、蓝光、红光3种光质下,栅藻生物产率分别是0.21、0.04、0.03 g ·L^-1·d^-1,白光条件下栅藻生长相对较好。50 mg·L^-1低浓度NH₄⁺-N下栅藻生长较好,其生物产率优于BG 11培养基,分别为0.20、0.18 g·L^-1·d^-1;500、2000 mg·L^-1高浓度NH₄⁺-N下,藻细胞生长缓慢,生物产率仅为0.12、0.11 g·L^-1·d^-1。在Cu²⁺浓度分别为0.5、1.0、2.0 mg·L^-1的培养液中,藻细胞生物产率分别为0.18、0.15、0.13 g·L^-1·d^-1。一定浓度NH₄⁺-N存在下,栅藻能耐受较高的Cu²⁺浓度。     

城市污水的微生物-植物联合修复对水体N2O、N2和O2释放的影响

针对城市河道污染水体治理这一问题,采用自主研发的自然水体原位收集装置对微生物和微生物-植物联合修复过程中气体N₂O、N₂及O₂释放的特征进行野外原位监测。结果表明:微生物菌剂和微生物-植物联合净化期间水体氧化亚氮(N₂O)释放速率均值分别为10.68、5.91 μmol·m^-2·h^-1,与对照比,降幅分别为16.37%和53.86%;氮气(N₂)释放速率均值分别为1.49、0.87 mmol·m^-2·h^-1,降幅分别为5.70%和67.54%;氧气(O₂)释放速率均值分别为1.14、0.69 mmol·m^-2·h^-1,降幅分别为14.93%和72.06%;微生物菌剂及微生物-植物联合净化期间,目测水体透明度转好,藻类含量降低,水体溶氧由超饱和状态(17.17 mg·L^-1)降至正常水体溶氧水平(9.49 mg·L^-1),降幅达到50%,可能是水体氧气释放速率降低的原因。因此,微生物-植物联合净化能显著降低水体N₂O、N₂及O₂的释放速率,推测是由于微生物和水生植物对水体养分的同化作用产生营养竞争,抑制了微生物反硝化作用产生N₂O、N₂并抑制藻类生长产生O₂及增加水体溶氧的原因。     

天然产物中木栓烷型三萜核磁共振波谱特征

对天然产物中发现的木栓烷型三萜化合物的¹³C-NMR、¹H-NMR谱学特征进行综述,以期减少天然产物特别是木栓烷型三萜结构鉴定工作的盲目性和重复性,为进一步研究分析木栓烷型三萜提供经验借鉴。     

高浓度非酯化脂肪酸诱导Ⅱ型酮病奶牛氧化应激

为探究Ⅱ型酮病奶牛的氧化应激状态及其诱因，采集健康和Ⅱ型酮病奶牛的血液样品，并分析氧化应激和肝损伤相关指标。结果表明：Ⅱ型酮病奶牛血液中NEFA、MDA和H2O2的含量高于健康奶牛，而CAT、SOD和GSH-Px的活性低于健康奶牛；此外，肝损伤的标志物，AST、ALT、GGT和GLDH的活性均高于健康奶牛，说明Ⅱ型酮病表现为氧化应激和肝损伤。体外试验表明，高浓度NEFA(1.2 mmol/L)显著增加奶牛肝细胞中ROS的含量，引起肝细胞氧化应激并释放大量AST和ALT，而添加抗氧化剂NAC可以缓解NEFA引起的肝细胞氧化应激和损伤。这些结果说明高浓度NEFA通过诱导肝细胞氧化应激引起肝损伤，研究有助于明确Ⅱ型酮病的发病机理，为Ⅱ型酮病的防治奠定理论基础。     

不同作物秸秆生物炭对溶液中Pb2+、Cd2+的吸附

为研究秸秆生物质炭的性质特征对其吸附重金属的影响,在限氧条件下将粉碎的小麦、水稻、玉米秸秆于450℃热裂解制备三种秸秆炭。研究了三种秸秆炭对溶液中Pb²⁺、Cd²⁺的吸附特性,并对其性质特征进行了测定分析。结果表明:三种秸秆炭对Pb²⁺、Cd²⁺的吸附符合准二级动力学模型,小麦、水稻、玉米三种秸秆炭对Pb²⁺的吸附速率分别为0.044、0.019、0.012 mg·g^-1·h^-1,对Cd²⁺的吸附速率分别为0.195、0.164、0.070 mg·g^-1·h^-1.三者对不同浓度下Pb²⁺、Cd²⁺的吸附符合Langmuir等温吸附模型,小麦、水稻、玉米三种秸秆炭对Pb²⁺的吸附容量分别为99.65、110.31、88.82 mg·g^-1,对Cd²⁺的吸附容量分别为30.64、29.39、21.47 mg·g^-1;在溶液pH 2.5~3.5时,三者对溶液中Pb²⁺、Cd²⁺的去除率急剧增加。小麦和水稻秸秆炭含有较高的碳酸盐、磷酸盐等无机矿物组分以及相对较高的阳离子交换量,对溶液中的Pb²⁺、Cd²⁺的去除可能是由于化学沉淀作用较强烈,而玉米秸秆炭的有机碳及官能团含量较高,孔隙结构较好,比表面积大,可能主要通过表面吸附及官能团的络合作用去除溶液中Pb²⁺、Cd²⁺.     

Cd2+对伸展摇蚊及黄色羽摇蚊幼虫的毒性效应研究

依据《化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法》(GB/T 27859—2011),以死亡率、羽化率、羽化时间和口器畸形率为观测指标,分别研究了加标水体和沉积物中Cd²⁺(CdCl₂·2.5H₂O)对伸展摇蚊(Chironomus riparius)和黄色羽摇蚊(Chironomus flaviplumus)的急性(96 h)和慢性(20 d)毒性。结果表明,摇蚊幼虫存活率与水和沉积物中Cd²⁺浓度呈显著负相关(P<0.01),水中Cd²⁺对三龄伸展摇蚊幼虫和黄色羽摇蚊幼虫的96 h半致死浓度(LC₅₀)分别为22.39 mg·L^-1和33.41 mg·L^-1,沉积物中Cd²⁺对伸展摇蚊幼虫及黄色羽摇蚊幼虫的20 d LC₅₀分别为226.26 mg·kg^-1和351.84 mg·kg^-1。摇蚊幼虫口器畸形率与Cd²⁺浓度显著正相关(P<0.01);伸展摇蚊羽化时间与Cd²⁺浓度无显著相关关系,黄色羽摇蚊羽化时间与Cd²⁺浓度显著正相关(P<0.05)。死亡率和口器畸形率表明,伸展摇蚊对镉污染的敏感性要高于黄色羽摇蚊。     

夏季台湾海峡南部海域上层水体的生物固氮作用

2011年6-7月,利用¹⁵N₂示踪法实测了台湾海峡南部海域的生物固氮速率,结合温度、盐度、天然颗粒物氮同位素组成的分布,分析并讨论了影响研究海域生物固氮速率的环境因素。结果表明,夏季台湾海峡南部海域的生物固氮速率介于 168-1080 nmol m^-3 d^-1之间,平均为537 nmol m^-3 d^-1,较高的生物固氮速率大多出现在次表层水体中。研究站位的积分固氮速率变化范围为11-40 μmol m^-2 d^-1,平均为23 μmol m^-2 d^-1。积分固氮速率的空间变化与不同水团的影响有关,在受黑潮水影响的海域,生物固氮速率较高,而在上升流和受河流冲淡水影响的海域,生物固氮速率较低,说明较低的水温及较高的无机氮营养盐可能会抑制研究海域的生物固氮作用。研究海域天然颗粒物δ¹⁵N与生物固氮速率之间呈现良好的负相关关系,表明天然颗粒物氮同位素组成可定性指征研究海域生物固氮作用的强弱。     

牛旁检测诊断产后初期奶牛亚临床酮病研究

 酮病是奶牛的一种重要的营养代谢病。采用酮粉法、尿液分析试纸条、乳汁分析试纸条、试剂盒法分别对乳酮、尿酮和血酮含量进行检测,以血清β-羟丁酸含量1200μmol/L作为健康奶牛和亚临床酮病奶牛的诊断标准。乳汁检测试纸条和尿液分析试纸条的诊断标准分别为200μmol/L和15mg/dl（1470μmol/L）。酮病牛血清β-羟丁酸和葡萄糖的浓度分别为726±43μmol/L、3.42±0.05mmol/L,健康牛血清β-羟丁酸和葡萄糖的浓度分别为2563±238μmol/L、2.78±0.07mmol/L,差异显著（P<0.05）。乳汁分析试纸条的敏感性和特异性分别为67%和92%,尿液分析试纸条的敏感性和特异性分别为57%和85%,酮粉的敏感性和特异性的敏感性和特异性分别为60%和94%。使用乳汁分析试纸条牛旁检测是一种有效的奶牛亚临床酮病诊断方法。     

石灰性农田土壤-水稻系统根际与非根际土氮转化速率差异

为探讨石灰性农田土壤-水稻系统根际与非根际土的氮素转化特征差异,本研究以石灰性紫色土发育而成的水稻土为研究对象,通过采集水稻分蘖期和成熟期的根际与非根际土壤,开展¹⁵N成对标记室内好氧培养试验,并计算土壤各初级氮转化速率。结果表明：水稻分蘖期根际土初级矿化速率（4.45 mg·kg^-1·d^-1）和硝化速率（9.16 mg·kg^-1·d^-1）均显著低于非根际土（P<0.05）;水稻成熟期根际土初级矿化速率（6.75 mg·kg^-1·d^-1）和硝化速率（16.86 mg·kg^-1·d^-1）与非根际土无显著差异,但显著高于分蘖期根际土的初级矿化和硝化速率（P<0.05）。水稻分蘖期NH₄⁺-N固定速率显著高于成熟期,其中,分蘖期根际土NH₄⁺-N固定速率为19.75 mg·kg^-1·d^-1,与成熟期根际土相比增加了42.21%;此外,两个生育期的水稻根际土NO₃^--N固定速率均显著高于非根际土。水稻分蘖期根际土无机氮总固定速率显著大于有机氮矿化速率,有利于氮素的留存和周转,相应地,初级硝化速率显著降低,减少了土壤NO₃^--N损失。研究表明,水稻不同生育期对石灰性水稻土主要氮转化速率的影响具有差异,且这种差异可能受水稻生育期内土壤水分、根系分泌物及无机氮含量变化的调控。     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

盐分不均匀分布对紫花苜蓿生长和离子特征的影响

【目的】土壤盐分浓度在空间上呈不均匀分布,研究不均匀盐胁迫对紫花苜蓿生长、水分吸收、光合作用以及根叶部位K~+和Na~+的影响,探讨紫花苜蓿适应根部不均匀盐胁迫的生理机制,为紫花苜蓿耐盐品种培育及改良盐碱地紫花苜蓿种植技术提供理论依据。【方法】通过水培法,将紫花苜蓿幼苗的根均匀分成两部分置于分根装置中,给予两侧根部相同或不同浓度的NaCl处理,设置对照(0/0)、低盐胁迫根部分别为0 mmol·L~(-1)NaCl(0/400)和100 mmol·L~(-1)NaCl(100/300)的不均匀盐胁迫处理和均匀的200 mmol·L~(-1)NaCl胁迫处理(200/200),处理7 d后取样分析。【结果】不均匀盐胁迫与均匀盐胁迫均抑制了紫花苜蓿生长,导致水分吸收减少、叶片Na~+浓度增加和叶片K~+浓度减少。然而,0/400处理紫花苜蓿地上部分鲜重、水分吸收分别比200/200处理提高了24.3%和44.2%,其叶片Na~+浓度比200/200处理降低了53.6%、叶片K~+浓度与200/200处理无显著差异。0/400处理0侧根部水分吸收比对照提高12.3%、Na~+浓度是对照的10.5倍、K~+浓度与对照无显著差异。100/300处理紫花苜蓿地上部分鲜重、整株水分吸收、叶片K~+浓度均与200/200处理无显著差异。100/300处理叶片Na~+浓度比200/200处理提高了31.0%。100/300处理100侧根部水分吸收比对照降低了33.9%、Na~+浓度是对照的39.5倍、K~+浓度比对照降低了31.3%。0/400、100/300与200/200的蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度无显著差异且均显著低于对照,而0/400的净光合速率与200/200无显著差异,均显著高于对照,100/300的净光合速率与对照无显著差异。【结论】紫花苜蓿根部平均盐分浓度为200 mmol·L~(-1)NaCl时,一侧根部NaCl浓度等于或高于其半致死浓度,另一侧根部NaCl浓度为0 mmol·L~(-1)时,不均匀盐胁迫缓解了根部高浓度盐胁迫对紫花苜蓿生长的抑制,当低盐胁迫根部NaCl浓度为100 mmol·L~(-1)时,不均匀盐胁迫不能够缓解根部高浓度盐胁迫对紫花苜蓿生长的抑制。     

应用SELDI-TOF-MS技术对患脂肪肝奶牛血浆差异蛋白的分离鉴定及生物学分析

【目的】脂肪肝是围产期奶牛主要代谢性疾病之一,50%产后奶牛受其影响。产后奶牛生产力降低、繁殖性能低下、免疫功能减弱、肝功能衰竭和过早死亡都与脂肪肝有关。表面增强激光解析/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是一种对生物样本蛋白质研究的新型高敏感性蛋白质组学方法,文章旨在探讨脂肪肝奶牛血浆蛋白质组学特征。【方法】于黑龙江某集约化养牛场选择产后7-28d,1-2胎次荷斯坦奶牛40头。清晨空腹尾静脉采血10mL,应用肝素抗凝（150U）迅速离心（3 000 r/min,5 min）分离血浆,置于-80℃冰箱冷冻保存。依据血浆甘油三酯（TG＞0.20 mmol·L^-1）, 血浆β-羟丁酸（BHBA＞1.2mmol·L^-1）浓度和临床症状,将其分为试验组（T）20头和健康对照组（C）20头。应用SELDI-TOF-MS技术测得血浆蛋白质谱,利用Ciphergen Protein Chip Software (Version 3.1.1)对在试验组和对照组所有样品中得到的峰图进行分析,得到原始数据。将两组之间的数据峰值做wilcoxon sum rank test统计检验,用计算出的P值判断峰在两组中是否有显著差异。以0.01作为P值的阈值,筛选出P值小于0.01的差异峰。在得到的差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比 (mass to charge ratio,m/z)进行比较,找到最相似的蛋白作为差异峰可能检测蛋白的预测结果。【结果】与对照组相比,试验组奶牛血浆蛋白质谱存在39个差异峰,在得到的39个差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比值进行比较,最终获得26个可预测的差异峰,预测蛋白11种。结果显示,相对于C组,11种预测蛋白在T组中均表达下调。通过生物信息学（Network,GO,Pathway）分析,应用Cytoscape软件对获得的11种蛋白进行牛类基因网络搜索,得到Networks分析结果图。在数据库中搜索到了试验结果中的淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)和纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain, FGA)两种差异蛋白,并得到其相关的Networks分析结果。应用Cytoscape软件中BinGO插件对11种蛋白进行GO分析,并得到GO分析结果。对这些蛋白质经软件搜库得到已经注释的差异蛋白有9种,分别为FGA、血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein, SAA)、血浆蛋白酶c1抑制剂（plasma protease c1 inhibitor, SERPING1 or C1INH）、血清载脂蛋白-CⅢ（apolipoprotein c-Ⅲ,ApoCⅢ）、海帕西啶（hepcidin, HAMP）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN or SPP1）、 甲状腺素运转蛋白（transthyretin, TTR）、胱蛋白酶抑制剂C （cystatin-c, CysC or CST）、神经分泌血管生长因子蛋白（neurosecretory protein, VGF）。应用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway数据库搜索。搜索结果显示只有6种蛋白质可在数据库中搜到,分别是FGA、SERPING1、APO-CⅢ、APP、CysC、SPP1。并得到其相关的Pathway分析结果。这些蛋白可能是与奶牛脂肪肝发病机制相关的物质。【结论】应用SELDI-TOF-MS技术有效的分离了健康牛与患病牛之间的血浆差异表达蛋白,均在肝脏代谢或脂肪肝疾病发生发展过程中起重要的调节作用,对探究奶牛脂肪肝发病机理及其对机体生物学功能的影响具有重要的理论价值。差异蛋白对奶牛脂肪肝的发病机理的影响尚待进一步研究。     

海岛棉苗期盐胁迫下形态学和生理学指标变化

【目的】在300 mmol·L-1 Na Cl胁迫下,观察并测定海岛棉耐盐性强的品系越海9号和耐盐性弱的品系PS-7叶片、茎细胞解剖结构和生理学指标,从形态学和生理学两个水平研究海岛棉苗期响应盐胁迫的应答机制,为棉花耐盐材料的筛选提供理论依据和技术方案。【方法】采用水培方法,待棉苗生长至3叶期时,开始进行300 mmol·L-1 Na Cl胁迫处理。运用光学显微技术及生理学指标测定法,在不同Na Cl胁迫处理时间下,对海岛棉耐盐性强的品系越海9号和耐盐性弱的品系PS-7进行形态学观察及生理学指标分析。【结果】2份海岛棉材料对Na Cl胁迫的反应不同。随着300 mmol·L-1 Na Cl处理时间的延长,与对照相比,越海9号和PS-7的叶片和茎的横切面面积均显著变小,处理24 h时,分别变小14.10%、54.69%与45.30%、87.90%,PS-7的变化幅度大于越海9号;处理12 h时,PS-7维管束中木质部已经损害严重,越海9号维管束中木质部则没有明显变化;PS-7的栅栏组织细胞在处理24 h时由长圆柱形变为卵圆形,越海9号的栅栏组织细胞的形状则没有变化。生理学研究表明,越海9号叶片中的叶绿素含量、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性在整个处理过程中均高于PS-7,而其丙二醛含量却明显低于PS-7;在300 mmol·L-1 Na Cl处理8 h时,越海9号和PS-7中的丙二醛含量、叶绿素含量、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均达到了显著性差异。【结论】叶片中栅栏组织和茎中木质部可能是海岛棉响应盐胁迫的最敏感部分,叶绿素、丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化物酶可作为鉴定耐盐棉花材料的生理学指标。     

奶牛临床和亚临床酮病的血浆代谢组学研究

【目的】基于代谢组学的气相色谱(GC)/质谱(MS)联用技术分析临床酮病、亚临床酮病和健康的奶牛血浆代谢谱,观察奶牛体内代谢产物的变化,寻找内源性代谢分子标记物,用于发现奶牛临床和亚临床酮病的早期诊断及病情进展的特征生物标志物,并阐明该病发病机制。【方法】收集临床酮病奶牛血样24例,亚临床酮病奶牛33例,健康对照组奶牛23例,静脉采集试验奶牛血液,分离血浆,检测其β-羟丁酸、血糖等生化指标。将血浆样品预处理后,运用GC/MS联用技术检测各组奶牛血浆代谢产物,利用质谱数据库对其进行鉴定。采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘判别分析法（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）等多元统计方法对临床酮病组、亚临床酮病组和健康对照组奶牛检测数据进行模式识别分析。通过PLS-DA方法建立疾病诊断模型后,筛选潜在的疾病生物标记物。【结果】 以80例奶牛血浆样品为分析对象,研究建立了内源性代谢物谱的GC/MS分析方法,并利用NIST（2008）商业质谱数据库对检测到的代谢物进行快速鉴定,共检测出267个变量。将代谢组数据导入SIMCA-P软件进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析,代谢组数据可将患病组与健康组分别聚类区分,并且寻找到组间种类无差别代谢物为40种。结果显示与对照组相比,临床和亚临床酮病的差异代谢物均为32个,临床酮病与亚临床酮病组相比有13个差异代谢物。通过查找KEGG数据库,对代谢物进行分析,这些代谢物主要与氨基酸代谢、脂肪代谢和碳水化合物代谢等能量代谢途径相关。【结论】基于代谢组学的GC/MS技术对酮病奶牛血浆进行检测,并结合多元统计分析,共在临床、亚临床酮病和健康组之间发现40种代谢物（主要为脂肪酸,氨基酸和碳水化合物等物质）。证明奶牛血浆样品的GC/MS代谢谱可以有效地对临床酮病组、亚临床酮病组与健康对照组进行区分。该结果也进一步证明了利用代谢组学技术,在一定程度上可以揭示奶牛临床和亚临床酮病的发生和发展变化,而这些对组间分类有贡献的差异代谢物可能是奶牛酮病诊断的潜在代谢标记物和客观指标。通过研究可以发现奶牛临床和亚临床酮病的发生和发展过程中,其血浆内的部分代谢物的代谢模式和代谢途径发生了改变。此外,新的潜在的代谢物也为奶牛酮病的诊断和预防提供了一定的新思路。     

盐胁迫下苗期栽培大豆生理响应及Na~+动态平衡关键基因的表达

【目的】研究耐盐栽培大豆和盐敏感栽培大豆对盐胁迫的响应,特别是盐胁迫对大豆幼苗光合特性、离子含量及Na~+动态平衡相关基因表达的影响,通过比较盐胁迫下不同大豆品种的响应差异,揭示不同基因型大豆耐盐机制,为大豆栽培管理、耐盐品种的选育及人工调控提供理论参考。【方法】以耐盐栽培大豆(Y8D6008、Y8D6013)和盐敏感栽培大豆(Y8D6132、Y8D6136)为材料,选取长势一致的大豆幼苗于1/2×Hoagland营养液中培养,待第一片复叶完全展开时,营养液中加入Na Cl,每天递增50 mmol·L~(-1)到达处理浓度150 mmol·L~(-1),处理持续7 d。以不加Na Cl的1/2×Hoagland营养液作为对照,研究盐胁迫下大豆幼苗的光合特性、离子含量及Na~+动态平衡相关基因表达变化。【结果】150 mmol·L~(-1) Na Cl不同程度地抑制了4种大豆幼苗生长,同时显著降低SPAD值、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,但是Na Cl胁迫对盐敏感大豆影响程度显著高于耐盐品种;盐胁迫显著降低耐盐大豆的胞间CO2浓度,而盐敏感大豆与之相反,说明150 mmol·L~(-1) Na Cl处理下气孔限制是引起耐盐品种光合速率下降主要因素,而盐敏感品种光合速率下降主要因素是非气孔限制。对大豆植株的不同离子含量进行测定,发现盐胁迫下4种大豆叶片中Na~+积累均显著升高,盐敏感品种上升幅度显著高于耐盐品种,而K~+含量与Na~+含量的变化规律相反。盐敏感大豆叶片中磷含量(P)均受盐胁迫显著下降,而耐盐大豆叶片P在胁迫后略有增加。相关分析表明净光合速率变化幅度与叶片中Na~+、K~+和P含量变化幅度存在显著的相关性。对6个参与大豆植株体内Na~+动态平衡相关基因Gm SOS1、Gm Ncl1、Gm SALT3、Gm NHX1(离子通道基因)、Gm CIPK1(信号转导基因)和Gm AVP1(能量运输相关基因)相对表达量进行分析,发现盐胁迫后4种大豆的Gm Ncl1表达量均显著上调,盐敏感品种上调倍数高于耐盐大豆品种,这种表达变化与大豆的耐盐性具有一定的关联性,而其他5个基因表达量与大豆的耐盐性没有明显的关联性。【结论】与盐敏感大豆相比,耐盐大豆在盐胁迫环境条件下减少Na~+在叶片中的积累,保持相对较高的K~+和P含量,并维持相对较高的光合速率,这是耐盐大豆比盐敏感大豆具有较强耐盐特性的因素之一,另外Na~+动态平衡相关基因GmNcl1可能与大豆耐盐特性有一定关联性。     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

转TaNHX2大豆的耐盐性分析

【目的】在盐胁迫条件下,通过对转TaNHX2(小麦Na⁺/H⁺转运蛋白编码基因)大豆的盐害表型、光合作用强度以及产量相关农艺性状的考察,评估其生产应用潜力,以期获得具有一定应用价值的耐盐大豆新种质。【方法】以实验室前期获得并初步鉴定具有一定耐盐性的转TaNHX2大豆T₄代株系为材料,在主茎第二片复叶完全展开时（V₃期）进行草丁膦抗性、PCR和RT-PCR检测。选取阳性植株,在主茎第三片复叶完全展开时（V₄期）进行NaCl胁迫处理,处理期间观察记录盐害表型;待植株长至初荚期（R₃期）测定其光合作用参数;最后,分单株收获已生长至完熟期（R₈期）的大豆植株,考察其株高、节数、单株荚数、单株粒数和单株粒重。其中,昌平春播试验点设置0、150和200 mmol·L^-1 3个NaCl浓度,北圃场夏播试验点设置0和200 mmol·L^-1 2个NaCl浓度,盐害表型观察以及光合作用参数测定只在北圃场试验点进行。【结果】分子鉴定表明外源TaNHX2在转基因后代中成功转录表达,遗传稳定。在无盐胁迫条件下,转基因与受体植株长势相当,叶片大小相似,光合作用强度相近。而在200 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫处理下,转基因与受体植株均出现矮化、叶片变小、光合作用强度降低的现象,但与受体植株相比,转基因大豆株系C12、C21和C19的矮化程度较低,叶片较大,光合作用相关参数数值较大,其中株系C12和C21与受体的净光合速率（Pn）差异具有显著性。另外,无盐胁迫条件下,转基因株系与受体品种自贡冬豆各产量相关农艺性状数值相近,而在昌平试验点设置的150和200 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫下,转基因株系各农艺性状数值均高于受体对照,其中150 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,C12、C21和C19的单株粒重,C19的单株荚数与受体差异显著。200 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理时,株系C12、C21和C19的单株荚数、单株粒数和单株粒重,C12和C19的株高均与受体对照品种存在显著性差异。在北圃场试验点设置的200 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理下,转基因株系C12、C21和C19的株高、C19的单株粒数和单株粒重与受体对照品种具有显著性差异。【结论】在盐胁迫条件下,与受体对照品种相比,转TaNHX2大豆株系C12、C21和C19盐害程度较低,能维持较强的光合作用和一定的产量,其中株系C19在2个试验点的产量表现均较佳,具有较大的育种应用价值。      

褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在m RNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h,当细胞密度达60%—70%时,使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次,然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度(0、10、20、30、50 mmol·L-1)的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h,观察和统计INS-1细胞的形态学变化。利用Easy Pure?RNA Kit提取INS-1细胞的总RNA,核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度,其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量,Trans Script One-Step g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录合成c DNA。利用Primer Premier5.0引物设计软件,参考Gen Bank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα引物的设计。应用q RT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCαm RNA水平的变化。【结果】用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后,观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显,而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大,但突触增长却不明显;培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中,Insulin1 m RNA水平呈现先升后降的趋势,Gαi1 m RNA水平则呈现先降后升的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组,Insulin1 m RNA水平显著增加(P0.05),Gαi1 m RNA水平显著减少(P0.05),而Gαi2和Gαo则无显著变化(P0.05),因而Gαi1表现出与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性;20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L-1葡萄糖处理组相比,20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 m RNA水平显著增高(P0.05),且Insulin1和PKCαm RNA水平显著减少(P0.05),PKA m RNA水平则减少不显著(P0.05)。【结论】褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达,减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生。褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 m RNA水平增高而抑制PKCα的表达,使得Insulin1的表达受到抑制,胰岛素分泌减少,使血糖在夜间得以维持相对恒定。     

解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^TM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^-1;70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^-1;100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^-1。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13-C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z= 1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9 Da,是C15-C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13-C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·mL^-1 bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·mL^-1surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·mL^-1,发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。