动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。     

不同干燥方式对蓝莓叶中酚类物质及其抗氧化活性的影响

【目的】探讨对蓝莓叶酚类物质含量及抗氧化活性的影响,为蓝莓叶的综合开发利用提供参考。【方法】以蓝莓叶为试验材料,设置不同干燥方式处理分别采用福林酚和比色法、亚硝酸盐比色法及高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测各样品的总酚、总黄酮、绿原酸和芦丁含量,采用亚铁还原力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）、DPPH和ABTS⁺自由基清除法测定各样品的抗氧化能力,并分析样品酚类物质含量与抗氧化活性的关系。【结果】4种干燥方式对蓝莓叶中总酚、总黄酮含量及多酚类组份均有不同程度的影响。其中,真空冷冻干燥蓝莓叶中酚类物质含量最高,总酚（55.7 mg GAE·g^-1 DW）、总黄酮（104.8 mg RE·g^-1 DW）两者含量均为微波干燥方式的1.2倍左右,真空和热风干燥方式的3倍左右;多酚单体绿原酸（38.3 mg·g^-1）、芦丁（10.2 mg·g^-1）两者含量是微波干燥方式的1.5倍左右,热风和真空干燥方式的2-6倍。不同干燥方式对蓝莓叶的抗氧化活性影响显著（P＜0.05）。其中,真空冷冻干燥样品的抗氧化能力最强,DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为54.8 µg·mL^-1和183.9µg·mL^-1,亚铁还原能力FRAP值达到6.0,抗氧化能力略高于微波干燥法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为61.8 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值4.0）。微波干燥法样品的抗氧化能力显著高于热风干燥（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.6 µg·mL^-1和575.1 µg·mL^-1,FRAP值1.7）和真空干燥方法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.1 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值1.8）(P＜0.05)。热风和真空干燥样品间抗氧化活性没有明显差异(P＞0.05)。相关性分析表明,除芦丁外,其他酚类物质含量与其抗氧化活性均存在极显著相关(P＜0.01)。【结论】真空冷冻干燥能较好地保留蓝莓叶中的多酚类物质,且具备较强的抗氧化能力和还原能力;微波干燥的效果略低于真空冷冻干燥,生产上可根据样品处理量的大小和具体情况选择干燥方式。     

农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究

【目的】黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,是政府重视、社会关注的一大焦点问题,因此亟需研究建立黄曲霉毒素高灵敏高快速检测方法。目前已研制出高特异性高灵敏度黄曲霉毒素单克隆抗体,本研究旨在应用该抗体,建立黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测技术,为农产品质量监管、风险评估提供技术支持。【方法】本研究通过将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记,利用自主研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行黄曲霉毒素检测,通过检测线T信号值与质控线C信号值的比值和标准溶液浓度的自然对数值实现定量。针对花生、稻米、植物油等不同农产品,研究建立样品粉碎均质提取一体化技术。对铕标记时间分辨荧光免疫层析检测技术进行方法学考核,以花生、稻米、植物油等为例,进行实际样品检测,并与HPLC法进行结果比对。【结果】在花生、稻米、植物油等农产品实际样品检测中,本研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B₁得到检测限均为0.3 μg·kg^-1,线性范围分别为0.8-25、0.8-15和0.8-30 μg·kg^-1。上述3种农产品对应的标准曲线的线性方程分别为y=0.238x+0.654（R²=0.992）、y=0.321x+0.811（R²=0.990）和y=0.146x+0.173（R ²=0.993）,标准偏差分别为0.024、0.039和0.021。该方法的批内准确度和精密度添加回收试验结果表明,添加回收率在81.0%-113.0%,变异系数在7.2%-14.2%;批间准确度和精密度试验结果显示,添加回收率在75.8%-114.9%,变异系数在7.7%-15.3%。说明该检测技术批内、批间均具有良好的准确度和精密度。该方法与HPLC法检测结果相比,相对误差小于10%,说明黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析技术与行业标准方法检测结果具有良好的一致性。【结论】时间分辨荧光免疫层析检测技术灵敏度高、线性范围宽,重复性和稳定性好,是一种适合中国国情的实用快速检测技术,具有广阔的应用前景。     

中国不同麦区小麦籽粒硒的含量及调控

【目的】通过取样调查和田间叶喷硒肥试验,研究中国不同麦区小麦籽粒硒含量状况、硒含量的影响因素以及提高硒含量的农艺措施。【方法】分别于2008-2009、2009-2010、2010-2011年小麦季收集中国不同麦区73份春小麦和582份冬小麦共计655份田间小麦样品,调查籽粒产量并测定籽粒硒含量。于2010-2011年在14个省（市）的30个国家小麦产业技术体系综合试验站开展叶面喷施硒肥试验,设叶面喷施清水或0.017%亚硒酸钠2个处理,于拔节中、末期各喷施1次,完全随机区组设计,重复3次,测定拔节前植株样品的硒含量和收获后籽粒产量和硒含量。【结果】655份小麦籽粒样品平均硒含量为64.6 µg·kg^-1,远不能满足以小麦为主食人群对硒的营养需求,变幅为0-821.0 µg·kg^-1,春、冬小麦平均分别为67.5和64.2 µg·kg^-1。有63%缺硒,19%偏低,仅有8%富硒,未发现有小麦籽粒硒含量达到中毒水平。小麦籽粒硒含量在不同区域表现为北部高于南部、西部高于东部。各地的田间试验表明,叶面喷施亚硒酸钠对小麦籽粒产量没有显著影响,不喷硒和喷硒平均产量分别为6 650和6 649 kg·hm^-2。叶喷硒肥使籽粒硒含量显著提高,不喷硒时,籽粒硒含量平均为31.0 µg·kg^-1,喷硒116 g·hm^-2使籽粒硒含量平均增加到647.8 µg·kg^-1,达到了富硒水平,但没有达到中毒水平。每施用1.0 g Se·hm^-2,籽粒硒含量平均提高5.3 µg·kg^-1,施用51 g Se·hm^-2可将小麦籽粒硒含量从平均31.0 µg·kg^-1提高到300 µg·kg^-1以上。小麦籽粒硒含量不受产量的影响,但不喷硒时籽粒硒含量与0-20 cm土层土壤有效硒含量和拔节前植株硒含量分别呈显著和极显著正相关。土壤有效硒含量在6.3-30.7 µg·kg^-1每增加1.0 µg·kg^-1,不喷硒时籽粒硒含量平均增加2.1 µg·kg^-1,拔节前植株硒含量在0-147.2 µg·kg^-1每增加1.0 µg·kg^-1,不喷硒籽粒硒含量平均增加0.7 µg·kg^-1。喷硒后籽粒硒含量和硒强化指数均与拔节前植株硒含量极显著正相关。拔节前植株硒含量每增加1.0 µg·kg^-1,喷硒籽粒硒含量平均增加5.7 µg·kg^-1,籽粒硒强化指数平均增加0.043 μg·kg^-1（g·hm^-2）^-1。【结论】在农业生产中,通过拔节前土壤施硒提高土壤有效硒水平、在拔节中期或末期叶面喷施硒肥等,均可使植株累积较多的硒,并在灌浆期向籽粒转移,从而提高籽粒硒含量。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白1（chemosensory protein 1,CSP1）基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白（以下简称BtCSP1）,研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建pET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达BtCSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni²⁺-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）荧光探针作为报告子,利用荧光竞争结合法研究重组BtCSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol?L^-1 1-NPN滴定BtCSP1蛋白溶液,直至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止,然后再以各供试配基滴定BtCSP1-1-NPN体系,通过配基竞争猝灭1-NPN最大发射波长,并用Scatchard等方程计算表征BtCSP1与配基亲和力大小的解离常数K_D。【结果】克隆了Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,经双酶切和连接构建了pET-30a(+)/CSP1重组质粒,在IPTG终浓度为1 mmol?L^-1的条件下诱导获得了BtCSP1重组蛋白,Ni²⁺-琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度,稀释至1.5 µmol?L^-1作为工作浓度。在荧光光谱试验中,Scatchard方程线性化后（相关系数达到0.9967）,显示BtCSP1与1-NPN的解离常数K_1-NPN为2.78 µmol?L^-1,结合位点数n为0.82,表明两者结合较好,且基本是1:1结合,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中,有多种供试植物挥发物分子能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物,如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯（K_D值分别为26.47、39.43、54.01和83.46 µmol?L^-1）,且3-蒈烯具有较强的竞争结合能力,能在200 µmol?L^-1时将1-NPN报告子相对荧光值竞争至约40%。【结论】Q型烟粉虱CSP1蛋白能与测试的多种寄主植物挥发物产生较为广谱的结合能力,尤其与对烟粉虱有趋避性的挥发物的结合更强,表明CSP1很有可能参与Q型烟粉虱对非寄主植物的趋避行为,这对揭示其入侵寄主选择行为生理机制具有重要意义。     

采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性

【目的】探究双峰驼CYP3A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过夜12 h,颈静脉放血处死后,立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织,洗去血污称重匀浆后,采用Ca²⁺沉淀法制备双峰驼肝微粒体,并通过BCA法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系,取不同浓度的双峰驼肝微粒体蛋白悬液（0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg?mL^-1）、不同浓度的探针药物咪达唑仑（MDZ）（7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1）分别加入到孵育体系中,37℃预孵育5 min后,加入NADPH溶液后再孵育不同时间（0、2、5、10、15、20、25、30 min）。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮（DZP）溶液,涡旋混匀,800 µL全部混合液体经14 500 r/min离心20 min后,取20 µL上清液进行高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV）,确定最适底物浓度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1 MDZ探针药物溶液20 µL与双峰驼肝微粒体共同孵育15 min后,以混有内标DZP的冰冷甲醇终止反应,采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物1'-羟基咪达唑仑（1'-OHMDZ）的动态含量,计算出部分药物动力学参数。色谱条件：Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相为V（乙腈）﹕V（0.01 mol?L^-1 PBS缓冲液）= 40﹕60;等浓度洗脱20 min;检测波长为254 nm;流速为0.8 mL?min^-1;柱温为30℃;进样量为20 μL。【结果】使用Ca²⁺沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了酶的良好活性,能满足后续体外药物代谢试验的基本要求,经BCA法测定其蛋白含量为(1.936±0.052) mg?mL^-1。双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物MDZ、PBS缓冲液、MgCl₂溶液以及NADPH溶液构成双峰驼肝微粒体孵育体系,随着孵育时间的延长,酶和底物进一步反应,当MDZ浓度为125 µg?mL^-1（终浓度为7.073 nmol?mL^-1）,肝微粒体浓度为2.000 mg?mL^-1（终浓度为0.050 mg?mL^-1）时,孵育15 min,酶和底物的结合最紧密,并呈现出饱和的状态,故确定其终浓度和时间为最适浓度和最佳孵育时间。经HPLC-UV法测定,1'-OHMDZ、MDZ和DZP的出峰保留时间分别为6.710、11.383和15.263 min,各成分色谱峰分离良好,且不受肝微粒体孵育体系中其他干扰峰的影响。HPLC检测方法的精密度、稳定性及回收率的试验结果均符合色谱测定的基本要求,即成功建立了准确、灵敏、可靠、重现性好的双峰驼CYP3A酶特异性探针药物的检测方法。以底物MDZ浓度和反应产物1'-OHMDZ生成速率进行Lineweaver-Burk双倒数作图,分别计算出最大反应速度V_max和米氏常数K_m。经Origin Pro8.6软件进行线性回归分析得到最大反应速度V_max为(0.380±0.028)nmol?mg^-1?min^-1,米氏常数K_m为(9.603±3.229)nmol?mL^-1,以此体现酶和底物的反应情况,并对双峰驼CYP3A酶的活性进行了间接测定。【结论】成功建立了跟踪检测CYP3A酶的特异性探针药物MDZ及其代谢产物浓度的高效液相色谱紫外检测方法。MDZ在体内经CYP3A酶的特异性氧化代谢后主要生成1'-OHMDZ,本文以MDZ的代谢产物1'-OHMDZ的生成速率为检测指标,首次对双峰驼CYP3A酶的体外活性及酶与底物的相互作用特点进行了研究。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

东方百合‘索邦’的离体培养研究

东方百合‘索邦’作为市售主流鲜切花百合品种,具有巨大的市场潜力。为满足市场需求,利用花器官作为初始材料,对东方百合‘索邦’离体培养涉及的愈伤组织诱导、丛生芽增殖及生根培养等相关技术进行研究。结果表明,子房为合适的初始诱导外植体,进一步扩繁诱导愈伤组织时适宜选用叶片下部或鳞茎片为外植体,合适的愈伤组织诱导培养基为MS+2.0 mg·L^-1 2,4-D+0.2 mg·L^-1 6-BA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。丛生芽增殖培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。生根培养基为MS+0.5 mg·L^-1 NAA +30 g·L^-1 蔗糖+6.5 g·L^-1 琼脂,pH 5.8。结果为进一步完善东方百合‘索邦’的离体培养体系,进行优质种球的规模化生产提供基础。     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

不同施氮量对设施茄子产量、品质及养分积累的影响

【目的】研究不同氮肥用量对日光温室茄子产量、品质以及养分积累的影响,为设施茄子精准施肥提供理论依据。【方法】以茄子品种茄杂2号作为材料,采用田间小区试验,设置4个施氮处理,以不施肥处理作为对照,测定不同施氮处理下茄子的产量、营养品质、干物质积累量以及养分积累量。【结果】茄子产量随着氮肥用量的增加呈现先增加后降低的趋势,适量的施氮量有助于提高茄子产量;试验F₃处理产量最高,为62 839 kg/hm²,比不施肥处理高36.05%。各施氮处理中,可溶性固形物、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量均随着氮肥用量的增加呈现先增加后降低的趋势,并且均以F₃处理最高,分别为1.83%、52.59 mg/g、1.8 mg/g。VC含量是F₄处理最高,为7.44 mg/100g。各施氮处理的硝酸盐含量随施氮量的减少而降低,F₅处理最低,为654.56 mg/kg。茄子植株氮素、磷素、钾素的积累量均随着氮肥用量的增加呈现先增加后降低的趋势,均以F₃处理最高,分别为232.67、34...     

灌溉定额分配及水磷耦合对滴灌苜蓿 生长规律的影响

【目的】 研究不同灌溉定额分配及水磷耦合对滴灌苜蓿(Medicago sativa L.)生长规律的影响。【方法】 设3种灌溉梯度,分别为:5 250 m³/hm²(W₁)、6 000 m³/hm²(W₂)、6 750 m³/hm²(W₃),在灌水量为6 000 m³/hm²(W₂)下,设3种灌溉定额分配模式:(1)刈割前灌溉本茬次总灌水量的35%＋刈割后灌溉本茬次总灌水量的65%(F₁)、(2)刈割前灌溉本茬次总灌水量的50%＋刈割后灌溉本茬次总灌水量的50%(F₂)、(3)刈割前灌溉本茬次总灌水量的65%＋刈割后灌溉本茬次总灌水量的35%(F₃)。在三种灌溉梯度下分别设3种施磷模式为:施P₂O₅ 50 kg/hm²(P₁)、100 kg/hm²(P₂)、150 kg/hm²(P₃)。【结果】 不同灌溉定额分配条件下,各茬次F₂处理苜蓿植株达到最快生长速率的天数最少为17~18 d,F₁处理苜蓿生物量的增长空间最大,且受灌溉定额分配的影响最小;不同水磷耦合条件下,各茬次W₃P₂处理苜蓿植株达到最快生长速率的天数最少为15~16 d,W₁P₃处理、W₂P₃处理、W₃P₃处理苜蓿生物量的增长空间最大,W₃P₃处理受水磷影响最小。【结论】 在苜蓿达到最大生长速率15~18 d时进行水肥管理效果最佳,且刈割前灌溉本茬次总灌水量的35%,刈割后灌溉本茬次总灌水量的65%,以及适宜灌溉量(6 000 m³/hm²)与施磷量(P₂O₅ 100 kg/hm²)的有效耦合,均有利于建植第二年滴灌苜蓿生长潜力的有效发挥。     

外源四价硒条件下硫对小麦硒吸收的影响机制

【目的】研究硫肥对外源四价硒条件下土壤硒赋存形态和价态变化的影响,旨在揭示硫调控小麦硒吸收的作用机制。【方法】以郑麦9023为试验材料,通过苗期土培和水培进行,土培试验设3个硫水平,分别为0、150和300 mg·kg^-1,硫源为硫磺,2个硒水平,分别为0和5 mg·kg^-1,硒源为亚硒酸钠,生长至70 d收获并取土样;水培试验先将幼苗在1/5 Hogland-Arnon营养液中培养2周,然后开始进行处理,设3个硫水平,分别为0、1和2 mmol·L^-1,硫源为硫酸镁,硒水平为10 µmol·L^-1,2种硒源,分别为亚硒酸钠和硒酸钠,培养24 h后收获,土培和水培试验均为完全交互设计,重复4次,采用HG-AFS-8220型双道原子荧光光度计对小麦地上部和根以及土壤中硒含量进行测定,根据与植物硒吸收的相关性,将土壤总硒分成不同赋存形态和价态。【结果】施用适量硒和硫对小麦生长均有一定的促进作用;150 mg·kg^-1硫可以显著降低小麦地上部和根中硒含量和硒累积量,降幅分别可达61.7 %、34.4%和55.7%、24.7%,但是这种降低不会随施硫量的增加而显著变化;施硫可以显著降低土壤pH值,最高可降低0.50个单位,并增加了土壤有机质含量,最高可增加0.78 g·kg^-1。施硫可以显著降低土壤中水溶态硒含量,并显著增加铁锰氧化物结合态硒含量,也增加了有机结合态和残渣态硒含量,而对交换态硒含量无显著影响,表明施硫促使了硒在土壤中的钝化。施硫可以显著降低水溶态中各种价态硒含量,其降幅基本一致,施硫可以增加交换态中四价硒含量而显著减少六价硒含量,表明施硫抑制了硒在土壤中向高效价态的转化。小麦对四价硒和六价硒的吸收差异与是否施硫密切相关,无硫时,六价硒处理下小麦地上部和根中硒含量分别为四价硒处理的44.7和22.4倍,而硫浓度为1 mmol·L^-1时,其硒含量迅速降为四价硒处理的2.8倍和51.8%,表明硫可以显著缩小小麦对四价和六价硒的吸收能力差异。【结论】施用适量硫肥在改善小麦生长的同时,可以通过降低土壤pH和提高有机质含量,促使水溶态硒在土壤中向铁锰氧化物结合态、有机结合态及残渣态的钝化,并抑制交换态中四价硒向六价态的转化,从而降低小麦对硒的吸收。因此,可以通过在高硒缺硫地区增施硫肥以及缺硒高硫地区减施硫肥来有效调控作物体内的硒含量     

茚虫威降解菌海藻酸钠微球制剂研制及应用效果

[目的]以海藻酸钠为载体制备降解菌斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ACCC 02521菌株微球制剂,确定该制剂降解农田土壤茚虫威的应用条件.[方法]通过微滴包埋成球法,将湿菌体重悬后加入海藻酸钠溶液,混匀后逐滴滴至CaCl2溶液造粒,低温固定后,以0.9％NaCl溶液洗涤,测定降解菌微球的传质性...     

葡萄胚挽救技术优化及无核和玫瑰香味新种质创制

【目的】研究葡萄玫瑰香味性状,为无核香味葡萄育种提供重要的材料基础,探究亲本基因型、胚发育形态以及生长调节剂对胚萌发的影响,进一步优化无核×玫瑰香味组合胚挽救体系,并结合分子标记技术初步对杂交后代进行无核性状鉴定。【方法】利用顶空固相微萃取结合气质联用方法,对10个玫瑰香味和无玫瑰香味葡萄品种的果实香味物质含量进行测定,从中筛选出浓香型品种作为亲本;结合课题组前期研究结果,以6个玫瑰香味品种为父本,5个欧洲无核品种为母本,配置13个杂交组合;无菌条件下,从幼果中剥离杂种胚珠,离体黑暗培养8周,随后将发育的杂种幼胚接种于添加不同激素浓度和比例的胚萌发培养基中,通过优化胚萌发培养基配方,提高幼胚萌发率和成苗率。幼苗经温室炼苗后,将成活的F₁代移栽至大田。利用分子标记早期辅助选择具有无核性状的F₁代杂种株系。【结果】萜烯类物质是玫瑰香味的主要呈香物质,8个玫瑰香味品种均能检测到萜烯类物质,其总含量为0.0246—1.3824。筛选出‘亚历山大’‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’等玫瑰香味物质含量相对较高的品种,可作为杂交亲本,用于创制兼具无核和玫瑰香味新种质;利用胚挽救技术从13个杂交组合获得杂种株系1 284个,移栽成活697株;以‘红宝石无核’和‘火焰无核’作为母本的后代成苗率较高,以‘阳光玫瑰’‘爱神玫瑰’‘红亚历山大’为父本的胚挽救成苗较好,其中‘红宝石无核’ב爱神玫瑰’杂交后代胚发育率和成苗率相对较高,分别为48.59%和51.71%;幼胚萌发率以WPM为基础培养基,添加1.0 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 ZT的生长调节剂时较高,达11.33%,高于对照的7.41%;分别利用3种无核相关分子标记GLSP1-569、SCF27-2000和SCC8-1018,对101个株系进行无核性状检测,表明使用不同的标记在27个株系均检测到特异性条带,初步确定以上携带无核特异条带的株系为无核株系。【结论】'亚历山大'和'阳光玫瑰' 的香味物质含量高,并且与欧洲葡萄杂交后其胚挽救效率高,是合适的香味父本材料;而‘红宝石无核’‘火焰无核’适合作为母本。胚萌发培养时,以WPM培养基添加适当浓度的KT及ZT有较好的促生根效果。通过分子标记对杂交F₁代无核性状检测率为26.73%。目前开发的玫瑰香味标记较少,本研究获得的杂种后代可为研究玫瑰香味基因标记提供重要的试材。     

模拟酸雨对番茄光合作用和病害发生的影响及油菜素内酯对其缓解效应

【目的】在全球气候变化大背景下,酸雨沉降日益加剧,严重影响蔬菜等农作物的产量、品质和抗性。油菜素内酯（brassinosteroid,BR）是一类植物体中广泛存在的植物激素,具有广谱调控植物抗性的作用。研究外源油菜素内酯对模拟酸雨环境下蔬菜作物光合作用和病害发生的影响,明确其对酸雨条件下蔬菜危害的缓解效应,对蔬菜作物安全生产提供指导。【方法】本研究以番茄（Solanum lycopersium L.）‘合作903’为材料,在模拟酸雨（模拟酸雨1（simulated acid rain 1,SiAR1）：NH₄NO₃（1.3 g·L^-1）、MgSO₄·7H₂O（3.1 g·L^-1）、Na₂SO₄（2.5 g·L^-1）、KHCO₃（1.3 g·L^-1）、CaCl₂·2H₂O（3.1 g·L^-1）,用1 N H₂SO₄调节pH至3.0;模拟酸雨2（SiAR2）：杭州地区春季收集的雨水,pH调至3.0）和对照（喷施dH₂O）条件下研究酸雨对番茄叶片光合作用和Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）引发的细菌性叶斑病发生的影响,其次在模拟酸雨和对照条件下对番茄叶片外源施用BR,研究外源施用BR对番茄叶片的光合特性和细菌性叶斑病发生的缓解作用,为了研究BR缓解作用的内在机制,测定番茄叶片光合作用关键基因FBPase、SBPase、rbcS和抗病基因PR1、NPR1的表达以及抗氧化酶的活性。【结果】模拟酸雨导致番茄叶片净光合作用速率（Pn）、光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）及光化学淬灭系数（qP）显著下降;模拟酸雨削弱了番茄对Pst DC3000的抗性,导致细菌性叶斑病发病率上升和菌落数显著增加。外源施用BR提高酸雨和对照条件下番茄叶片的光合作用,并有效增强了酸雨条件下番茄对Pst DC3000的抗性,使酸雨条件下叶片菌落数下降,光系统II实际光化学效率提高。探究BR缓解效应的内在机制发现,外源施用BR显著提高了番茄叶片光合作用关键基因FBPase、SBPase、rbcS和抗病基因PR1、NPR1等的表达,降低了膜脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量,并增加了愈创木酚过氧化物酶（G-POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性,从而缓解模拟酸雨对番茄光合和抗病性的抑制作用。【结论】外源施用BR能够显著提高番茄内源光合相关基因和抗病基因的表达及抗氧化酶的活性,有效促进酸雨环境中番茄等园艺作物的生长和增强抗病性。