菊花滑刃线虫及其检测和防疫方法

菊花滑刃线虫（Aphelenchoides ritzemabosi）是一种重要的植物寄生线虫,可寄生为害数百种植物,导致植物降低或失去经济价值,严重时导致植物落叶枯死.该线虫随着寄主植物繁殖材料和鲜切花进行远距离传播,被许多国家和地区列为检疫性植物有害生物,我国于2006年将其列为全国农业植物检疫性有害生物.本文描述了该线虫的形态鉴定特征、在国内外发生危害情况及其生物学和病理学特性,并介绍了该线虫的检测和防疫方法及措施.     

从拉脱维亚进境的介质中截获桑沃滑刃线虫

2006年2月，广东南海局接受了一批来自拉脱维亚介质的报检，该批介质为原厂包装未使用过的介质，主要成分为苔藓（peat—moss）。介质经我实验室浅盘法浸泡，分离得到4个属（种）的植物寄生线虫，包括有：滑刃线虫（Aphelenchoides sp．）、茎线虫（Ditylenchus sp．）、垫刃线虫（Tylenchus sp．）和长尾线虫（Seinura sp．）。由于滑刃线虫的数量相对较多，在分离的线虫种群中占绝对优势，我们对该线虫进行了细致的观察，并对相关形态特征进行了测量，获得了许多数据。通过查阅滑刃线虫分类鉴定资料，鉴定该虫为桑沃滑刃线虫（Aphelenchoides sansvali Chaturvedi ，Singh and Khera，1979），该虫的形态特征及测量数值如下。     

进境美国苜蓿草中苜蓿黄萎病菌的检疫鉴定

从一批进境的美国苜蓿草样品中分离得到了一株与苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)相似的分离物M1。该分离物原始菌落为白色,边缘规则呈圆形,菌丝较致密,气生菌丝较少,苜蓿组织块不被菌丝覆盖,菌落生长速度为小于2.5 mm/d;M1在PDA上进行纯培养,前6d内,菌落为白色圆形,容易产生分子孢子轮枝状分生孢子梗,7d后菌落中央表面因产生休眠菌丝开始变成黑褐色至黑色,20d后菌落的表面和背面大部分均变黑色,仍不产生微菌核和厚垣孢子。M1的DNA用V.albo-atrum特异引物Vaa1/Vaa2进行检测,PCR扩增后得到预期330 bp的产物片段,产物序列与V.albo-atrum相应序列的相似性为100%。该分离物接种苜蓿草根部,15d后引起苜蓿黄萎病的典型症状。根据分离物的形态特征、PCR检测结果、PCR产物序列分析,以及致病性测定结果,将进境美国苜蓿草样品中的分离物M1鉴定为苜蓿黄萎病菌。     

美国苜蓿草中鳞球茎茎线虫的鉴定

2015年,宁波口岸从美国苜蓿草中分离到一种茎属线虫,通过形态学和分子生物学方法,鉴定为鳞球茎茎线虫,这是我国口岸首次从牧草中截获该线虫。部分茎属线虫的核糖体28S和ITS基因DNA序列分析表明,28S基因是茎属线虫合适的DNA条形码基因。     

进境美国苜蓿草携带的真菌种类鉴定

为明确美国苜蓿草携带的真菌有害生物种类并为评估其风险奠定基础,从广东和江苏口岸进境的美国苜蓿草中挑拣出茎杆上有明显褐色至黑色斑点的可疑病害样品635份,经分离培养,获得菌株1382株。经鉴定,共有真菌37属52种,其中鞭毛菌1种,接合菌1种,子囊菌3种,担子菌1种,半知菌46种。     

从荷兰番红花种球中截获的次薄滑刃线虫的检疫鉴定

宁波口岸从荷兰番红花种球中分离到大量滑刃属线虫活虫,该荷兰群体的主要形态特征为:雌虫尾呈亚圆柱形,尾端半圆形,尾端腹侧有尾尖突长1.5~3.0μm;后阴子宫囊显著,长89.3~118μmm;侧线3条。基于28S、ITS和18S基因DNA序列构建NJ系统发育进化树显示该荷兰群体与次薄滑刃线虫亲缘关系极近且在同一进化分支中。通过形态特征和DNA序列分析,鉴定该荷兰群体为次薄滑刃线虫(Aphelenchoides subtenuis Cobb,1926)。     

危害马铃薯的茎线虫分离鉴定

本文对采自河北张家口市察北区、危害马铃薯的线虫(编号De-Chabei)进行了形态及分子生物学鉴定,形态测量结果表明其与马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)一致,采用通用引物rDNA1/rDNA2扩增rD-NA-ITS区的长度为1130bp,测序比对以及采用马铃薯茎线虫B型特异性引物DdL1/DdL2扩增得到485bp特异性片段,表明与B型或L型马铃薯腐烂茎线虫一致;再次证明该型线虫在河北马铃薯主产区的分布和危害。     

无锡口岸进境木质包装中截获的两种伞滑刃线虫的形态鉴定

松材线虫病是林业上的一种毁灭性病害.在进境木质包装检疫中,除该病的病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(steiner et buhrer)Nickel)外,还常常截获同属于伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.)的多种与之形态非常相似的线虫.本研究对进境木质包装检疫中截获的两种伞滑刃属线虫--B. rainulfi和B.conicaudatus进行了形态描述和鉴定.     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

无花果树苗中截获的无花果孢囊线虫形态和分子鉴定

上海口岸从旅客携带进境的树苗中分离到1种孢囊线虫属的2龄幼虫,通过形态特征和分子特征分析,鉴定为无花果孢囊线虫(Heterodera fici Kirjanova,1954)。该2龄幼虫的主要形态特征为:体长409.9~454.4μm;唇环3个;口针发达,长22.6~24.0μm,基部球圆形略向前倾斜;侧线4条;尾长圆锥形,末端细圆,尾部透明区长24.7~30.5μm,约占尾长的1/2。序列分析显示其ITS区序列与GenBank中无花果孢囊线虫的序列相似性为99.48%~99.90%,序列差异为1~5 bp。系统发育分析显示该线虫与无花果孢囊线虫处于一个聚类组内。这是我国口岸首次报道截获无花果孢囊线虫。     

鸢尾种苗中截获的草莓滑刃线虫形态和分子鉴定

草莓滑刃线虫是一种重要的叶和芽寄生线虫,可侵染多种重要花卉、经济作物,被列入我国检疫性有害生物名录。目前,草莓滑刃线虫的鉴定以形态学鉴定为主,但一线口岸常分离不到雌虫,鉴定困难。本研究采用形态特征和分子特征相结合的方法对草莓滑刃线虫进行鉴定:对鸢尾种苗中截获的滑刃属线虫群体雌虫、雄虫进行形态观察和形态测计并与已报道文献进行比较;PCR扩增该群体的rDNA-ITS区并测序,构建基于ITS序列的系统发育进化树;采用草莓滑刃线虫特异引物对该群体DNA样本进行扩增。结果表明:该群体与草莓滑刃线虫俄罗斯种群的测量值相接近;系统进化关系分析显示,该群体与NCBI公布的草莓滑刃线虫均处于同一进化支;采用草莓滑刃线虫特异引物PCR扩增可产生片段大小为169 bp的目的条带。     

进境哈萨克斯坦向日葵种子中向日葵黑茎病菌的鉴定

自进境哈萨克斯坦向日葵种子中,采用常规平板分离法获得1株疑似向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii菌株LL4,通过生物学性状、ITS序列测定和比对分析及致病性测定等方法对其进行了鉴定。结果表明,该病菌在PDA平板上培养初期菌丝无色,分隔分枝多,后期菌丝褐色或深褐色,常膨大;分生孢子器暗褐色,分散或聚集,球形、近球形或不规则形,大小为71.2~361.8μm;分生孢子形态变化较大,无色,单孢,肾形至椭圆形,大小为3.6~8.2μm×2.2~3.7μm,常含有2个油球;培养期间未见有性阶段。基于ITS序列分析比对发现,菌株LL4与Gen Bank中多个向日葵黑茎病菌分离物序列同源性达99%以上,系统进化树显示其与其它向日葵黑茎病菌分离物聚在同一个分支。菌株LL4可侵染向日葵根茎部,造成典型黑茎病症状。表明分离获得的菌株LL4为向日葵黑茎病菌P.lindquistii。     

紫花苜蓿下胚轴愈伤组织诱导及再生植株的研究

以培养4～5d的紫花苜蓿无菌苗的下胚轴为材料,改良SH(SH大量元素+MS微量元素+MS铁盐+UM有机)+水解酪蛋白(CH)2000 mg/L为基本培养基,对紫花苜蓿愈伤组织诱导和植株再生进行了研究。愈伤组织诱导和继代培养基分别为2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L及2,4-D 0.05 mg/L+BA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L,将获得的愈伤组织转入正交设计的培养基上进行筛选,得到了愈伤组织分化率相对较高的培养基配方:基本培养基+KT 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L,其分化率为73.0%。获得的再生芽在生根培养基上(1/2MSO)培养约10d便能获得具有根和叶的再生植株。本试验结果为下一步将来自蓝藻的Na⁺/H⁺ an-tiporter基因转入苜蓿,获得转基因耐盐苜蓿奠定了基础。     

进境苹果果实中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定

对来自美国的苹果进行了病原菌分离,结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)及β-tubulin引物(Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo)分别扩增和测序,菌株Nk-2968与Gen Bank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种苹果8 d后开始发病。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea kienholzii)。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。     

壶瓶枣褐斑病病原菌的鉴定

 近几年来,山西红枣发生了1种严重的果实病害,症状表现为果顶或果肩部位形成红褐色的病斑。本研究以壶瓶枣为材料,对病菌进行分离。通过室内和田间致病性测定以及人工接种后再分离病菌,证明编号为CN535的真菌菌株为该病的致病菌。该病菌在PDA上7d菌落直径达69.2~73.5mm,基内菌丝和气生菌丝均发达,具明显的浅灰与墨绿色的同心轮纹;分生孢子单生或短链生,具纵横隔膜和短喙,大小为(22.5~40.0)μm×(8.0~13.5)μm,为典型的Alternaria属真菌特征。其rDNAITS序列分析结果表明该菌与A. alternata、A. tenuissima、A. longipes、A. mali和A. citri的同源性均为100%。用2对链格孢菌的专用引物AAF₂/AAR3和Aalt-F/Aalt-R分别扩增出相对应的341和450bp的片段。综合形态特征和分子分析结果,确定壶瓶枣褐斑病的病原菌为A. alternata (Fries) Keissler。     

塔里木河中下游退耕地种植苜蓿试验效果分析

在塔里木河中下游对加拿大阿尔冈金紫花苜蓿 (Medicagosativa)进行施肥试验。结果表明 :该品种对施肥反应敏感 ,当磷、钾、追施氮肥为 30 0kg/hm2 ,4 5kg/hm2 ,2 1 0kg/hm2 时 ,效果最佳。刈割再生、分枝量、茎叶比性状均比不施肥、少施肥和其它施肥量显著 ,产量和品质大幅度提高