土壤中南方根结线虫的实时荧光PCR检测和定量

为了准确测定土壤中南方根结线虫Meloidogyne incognita的群体密度,根据序列特异性扩增区标记设计了南方根结线虫特异性引物和TaqMan探针,分别建立了卵和2龄幼虫的实时荧光PCR定量检测体系,并将该检测体系与显微镜计数法进行了比较.结果表明,引物Mi-F/R及探针Mi-probe对南方根结线虫具有高度特异性,建立的标准曲线循环阈值与卵和2龄幼虫数量的对数值之间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9771和0.9853,扩增效率均为90％,检测灵敏度为10-1个卵及10-3条2龄幼虫;对10个田间土壤样本的检测显示,实时荧光PCR定量检测与显微镜计数法测定的南方根结线虫卵和2龄幼虫数量呈显著正相关,且两种方法对2龄幼虫的测定结果无显著差异.     

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

 为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法,分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA (RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上,设计了多对SCAR PCR引物,并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物,它们组合使用可以可靠灵敏地鉴定南方、爪哇和花生根结线虫。3对引物的扩增灵敏度达1/3条的二龄幼虫、雄虫或雌虫,这表明本研究研制的PCR鉴定法可用于生产实践中土样和根样中3种根结线虫快速灵敏的鉴定。     

温度和湿度对南方根结线虫存活的影响

在实验室条件下,测试了不同温度处理对离体南方根结线虫存活的影响,结果表明,在25、30、35℃和40℃下,杀死90%以上离体南方根结线虫分别需要30d(100%)、26d(96.6%)、24d(94.1%)和9d(99.6%),而45、50℃下则需要15min和2.3min。同时测试了不同温湿度处理对土壤中南方根结线虫存活的影响,结果表明,25、30℃是土壤中根结线虫的适宜温度,当土壤含水量为14%时,40d死亡率分别为91.1%、90.4%;35℃线虫处于抑制状态,40d死亡率为85.3%;而线虫对40℃以上的高温敏感,随着处理温度升高,杀死线虫所需时间缩短。根结线虫在不同温湿度下的死亡情况不同,土壤温度为25～35℃,土壤含水量为6%是线虫的适宜湿度;土壤温度达到40℃且含水量为6%和14%时,杀死100%根结线虫仅需4d,不利于其存活;而50℃的高温和含水量达18%的高湿更不利于其存活。     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。     

无机化合物对南方根结线虫作用方式的研究

利用体外生物测定方法检测碳酸氢铵、硫酸铜和氯化铁在供试浓度下对南方根结线虫2龄幼虫（Meloidogyne incognita J2）存活的影响,以及药剂对其运动行为、个体发育、呼吸及体液外渗等的影响。结果表明,3种化合物在LC90浓度下使南方根结线虫2龄幼虫50% 致死时间不超过10.14 h,90%致死时间不超过22.66 h,离体条件下均对南方根结线虫2龄幼虫存活有强烈的抑制作用,显著降低了其运动行为,使其体长缩短、透明尾变长。并且,药剂处理均降低了线虫的呼吸作用,线虫悬浮液的电导率明显高于对照。     

象耳豆根结线虫的PCR鉴定和检测方法

 象耳豆根结线虫是一种在中国具有潜在经济重要性的农作物病原物。为提供有助于控制象耳豆根结线虫传播扩散的方法,研制了该线虫的快速PCR鉴定和检测法。该方法PCR引物的扩增目标为rDNA-IGS2区域,其设计依据象耳豆根结线虫与南方、爪哇、花生和北方根结线虫在该区域核酸序列的差异。通过对6种近似根结线虫的不同地理群体及自然土壤线虫群体的测试,验证了设计的PCR引物针对象耳豆根结线虫的特异性和可靠性。本方法具有快速灵敏的特点,可用于象耳豆根结线虫单条线虫的直接鉴定以及混合土壤线虫群体中象耳豆根结线虫的检测。     

甘肃省白银市保护地蔬菜根结线虫病病原鉴定

2012年5月-7月在甘肃省白银市采集了番茄、黄瓜、豇豆等几种保护地蔬菜的25个根结线虫群体.直接解剖获得雌虫,通过雌虫会阴花纹观察,结合酯酶和苹果酸脱氢酶(MDH-EST)测定,鉴定出所收集的25个群体中有16个为南方根结线虫[Meloidogyne incognita (Kofoid&White)],9个为爪哇根结线虫[M.javanica (Treub)].南方根结线虫为优势种群,本次试验也是首次在甘肃省发现爪哇根结线虫.     

湖南柑橘根结线虫种类鉴定及特异性PCR检测

根结线虫病是严重危害湖南柑橘生产的主要病害,快速准确地进行病原线虫鉴定,从而制定针对性的防治措施,对柑橘产业的稳定发展至关重要。运用形态学和分子生物学技术对湖南永州地区柑橘根结线虫进行病原种类鉴定,确定其为番禺根结线虫Meloidogyne panyuensis。通过引物设计与筛选,建立了番禺根结线虫特异性PCR检测技术。结果表明,该检测方法特异性好,灵敏度高,操作简单,能有效地从多种根结线虫中特异性检测出番禺根结线虫,为柑橘病原线虫的快速检测鉴定提供技术支撑。     

美国首次报道花生根结线虫侵染小花锦葵

2010年,美国在一次植物寄生线虫调查中发现,佛罗里达州马丁县的一个切花苗圃中的6株小花锦葵(Malva parviflora)上发现有根结虫瘿,这是植物受根结线虫侵染的典型症状。从田间小花锦葵植株根部采     

泰国爪哇根结线虫为害绿豆的栽培防治

试验结果表明,施用有机肥可有效地减少泰国爪哇根结线虫的密度。     

毒杀南方根结线虫的木霉种类鉴定及活性研究

木霉是国际上研究与应用非常普遍的生防真菌之一,具有重要的科研价值和广阔的应用前景。本研究采用形态学鉴定、ITS和β-tubulin序列分析法对4株具有杀线虫活性的木霉菌株进行种类鉴定,结果显示FT311和FT312为绿色木霉(Trichoderma viride),FT1937和FT85为哈茨木霉(T.harzianum)。利用贝氏皿浸没法测定,4株木霉发酵滤液均能显著降低南方根结线虫卵的孵化和2龄幼虫(J2)的活性,其中FT1937和FT85对卵孵化抑制率和J2致死率均达到85%~92%,而FT311能够达到80%~85%,但FT312毒性较低,仅达40%~60%;2株哈茨木霉的活性好于2株绿色木霉;同时观察到发酵液对线虫卵和幼虫体壁有消解作用、抑制和延迟卵孵化,并使幼虫体内空泡化。本研究为根结线虫病害的生防防治提供了更多的木霉资源信息。     

有机酸类化合物对南方根结线虫的生物活性

采用室内离体测定方法,测试了15种有机酸对南方根结线虫(Meloidogyne incognita) 2龄幼虫致死率和卵孵化抑制率。结果表明,甲酸和丙酸对2龄幼虫和卵的生物活性最高,明显优于其他供试有机酸,但是活性低于对照药剂阿维菌素。对生物活性结果及有机酸化学结构进行比对发现,小分子量化合物对南方根结线虫具有较高生物活性。     

南方根结线虫拮抗链霉菌的筛选和鉴定

通过生物测定和温室防病试验 ,对分离自江苏省南京、淮阴和上海三地 3 0份土样的 3 44株放线菌菌株进行筛选 ,得到了 1株对南方根结线虫有较高生物活性的链霉菌菌株LH1 2 1。其培养滤液在离体条件下对南方根结线虫二龄幼虫有较强的触杀作用 ,4h内击倒率达 1 0 0 % ,1 2h内致死率达 1 0 0 % ;番茄植株上的活体防病试验表明 ,2ml/株培养滤液对根结和卵块形成的抑制率分别为52 .8%和 63 .5%。遗传稳定性试验表明LH1 2 1菌株能稳定产生杀线活性物质。LH1 2 1培养滤液主要通过直接触杀二龄幼虫或干扰其侵入植株而达到防治目的。根据形态、培养和生理生化特性的分析 ,将LH1 2 1鉴定为玫瑰暗黄链霉菌     

三尖杉对花生根结线虫发育的影响

 采用室内培养和盆栽试验的方法,研究了三尖杉(Cephalotaxus fortunei)枝叶提取物及三尖杉枝叶粉末,对花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)发育的影响。结果表明,三尖杉枝叶提取物对花生根结线虫胚胎发育及二龄幼虫孵化有明显抑制作用。三尖杉枝叶粉末处理对花生根结线虫胚后发育的影响,主要表现在推迟二龄幼虫及成虫的发育,而对三龄及四龄幼虫的发育无明显影响。三尖杉枝叶粉末处理可显著降低雌虫的产卵量。     

10种植物提取物对南方根结线虫毒杀活性研究

采用触杀法研究了10种植物干材料无水乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物对南方根结线虫2龄幼虫的毒杀活性。结果表明,这10种植物材料的3种有机溶剂提取物对根结线虫都有不同程度的毒杀活性。其中,牡丹皮、丁香、八角茴香、何首乌和地肤子的无水乙醇和乙酸乙酯提取物的毒杀活性最强,48h校正死亡率均大于90%;八角茴香石油醚提取物也表现出较高毒杀活性,48h校正死亡率也达到了80%以上。     

聚多曲霉Snef210对南方根结线虫毒性的研究

蔬菜根结线虫病在我国乃至世界危害日益严重,安全防控该病害成为目前急需解决的农业生产问题。本研究筛选到一株可毒杀南方根结线虫Meloidogyne incognita的生防真菌Snef210,经形态学和分子生物学鉴定为聚多曲霉Aspergillus sydowii(Bain.et Sart.) Thom et Church。该菌株发酵液对南方根结线虫2龄幼虫(J_2)具有很强的毒杀作用,原液处理24 h后校正死亡率达90.1%,处理3 d后对卵孵化的抑制率达92.8%。盆栽试验中,与对照相比,菌株发酵液10倍稀释液土壤处理对番茄根部的根结减退率为66.7%。聚多曲霉代谢产物丰富,多用于抗菌和抗肿瘤的研究,本文首次发现其对南方根结线虫有效,是一类潜在的控制植物线虫病害的新型生防因子。     

南方根结线虫对生姜生长及内源激素的影响

 试验结果表明,南方根结线虫侵染生姜后,首先损伤根系,进而显著降低生姜植株的株高、地上鲜重、根系鲜重和根茎重,减产47.96%。南方根结线虫侵染可使生姜叶片中赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)含量显著降低,感病生姜的脱落酸(ABA)则表现为前期降低,后期增加的趋势,并促使叶片中GA/ABA的迅速下降,严重影响了生姜的生长,使感病植株矮小、叶片黄化,提前衰老。感病生姜根茎GA、IAA、ZR、ABA的变化规律与叶片相似,但9月份ZR、IAA含量的迅速上升,与根结线虫建立侵染据点、形成巨型细胞,从而造成根茎的局部疣裂有关。南方根结线虫侵染可引起病株根系GA/ABA升高以及GA含量在生长后期上升,促进营养物质向根部运输,从而造成根系的补偿性生长;但IAA和ZR含量的下降不利于根结线虫建立侵染据点,不能在根系中形成过多的根结。     

阿维菌素和硫线磷对南方根结线虫的毒力

利用阿维菌素和硫线磷处理南方根结线虫离体卵与幼虫,测试其对线虫卵和卵块孵化以及对2龄幼虫的致死作用、活动能力、侵入能力的影响。结果表明阿维菌素和硫线磷均对线虫卵和卵块的孵化表现很强的抑制作用,阿维菌素5 μg/mL处理24 h对卵孵化抑制率高达82.57%,而硫线磷40 μg/mL处理24 h对卵孵化抑制率为73.05%;阿维菌素和硫线磷处理48 h对2龄幼虫的LD50分别为7.346 1、13.345 6 μg/mL;在阿维菌素2 μg/mL和硫线磷3 μg/mL处理中,2龄幼虫在沙柱中的平均移动距离仅为0.04 cm和0.05 cm,而对照处理的线虫平均移动距离为1.04 cm;在阿维菌素2 μg/mL和硫线磷50 μg/mL处理2龄幼虫48 h后,对番茄根部的侵入率为0.12%和0.45%,而空白对照处理线虫的侵入率达21.85%。