双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法的建立与应用

近年来水稻发生了一种由菠萝泛菌Pantoea ananatis引起的新型细菌病害，其发生时期与白叶枯病相近，病症与白叶枯病类似。为了实现该病害与白叶枯病的快速检测，本研究基于泛菌属看家基因acnA,通过序列比对，设计了22对特异性引物，分别与已知的白叶枯病菌检测引物XOO80进行配对并筛选，建立了一种双重PCR检测方法，可从菠萝泛菌和白叶枯病菌中分别扩增出910 bp和162 bp的特异性条带，而其他10种非目标细菌均未有扩增条带，25μL体系中可稳定地从至少1 pg/μL的基因组DNA模板中扩增出特异性条带。本研究建立的菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度，为水稻细菌病害病原鉴定及防治提供了技术支撑。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

利用多重PCR技术快速检测4种水稻病原细菌

对水稻中多种病原细菌的检测,使用常规方法往往耗时耗力,而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测.根据水稻细菌性谷枯病菌gyrB基因,水稻细菌性叶鞘褐腐病菌PfsI/R quorum sensing位点以及水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌含铁细胞接受因子基因设计引物,建立4种水稻病菌的多重PCR检测方法,对方法进行...     

利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

玉米细菌性枯萎病菌PCR检测

 根据GenBank中玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的16S序列差异,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌特异性引物Ps2r/Ps3r,该引物能从供试的7株玉米细菌性枯萎病菌中特异性扩增出一条268 bp的预期条带,供试的32株近似种菌株都没有扩增产物;与国内外文献报道的其它5对特异性引物相比,除引物PSA/PSB外,引物DEP1/DEP2、ES16/ESIG2c、HRP1d/HRP3c和CPSL1/CPSR2c在不同程度上对部分近似种菌株出现了扩增。试验结果表明,引物Ps2r/Ps3r和PSA/PSB能特异性扩增玉米细菌性枯萎病菌,得到预期的扩增产物。对不同系列稀释度的DNA和玉米样品中病菌的检测结果表明,由引物Ps1/Ps4和Ps2r/Ps3r组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于引物ITSA/ITSB和PSA/PSB组合的巢式PCR方法,也高于Bio-PCR检测方法;前者可以检测到玉米种子中300 cfu/sample的目的细菌,该检测方法在进境玉米种子样品玉米细菌性枯萎病菌的检疫中具有比较理想的应有潜力和推广价值。     

双重PCR检测马铃薯晚疫病和环腐病方法的建立

通过克隆马铃薯环腐病菌和晚疫病菌转录间隔区(ITS)序列,并对测序结果进行同源性比较,选取差异位点分别设计了两对引物P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2,并检测了引物的特异性及方法的灵敏度。引物P.IN1/P.IN2可扩增出1条363bp马铃薯晚疫病菌的特异性条带,在DNA水平上其灵敏度达18fg/μL;引物C.IN1/C.IN2可扩增出1条218bp马铃薯环腐病菌的特异性条带,在细菌数上检测灵敏度为104 cfu/mL。混合这两对引物构建双重PCR反应体系,能从马铃薯环腐病菌和晚疫病菌的混合DNA及感染这两种菌的马铃薯植株中同时扩增到363bp和218bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和环腐病菌的快速可靠检测。     

稻曲病菌的SCAR标记及其PCR检测

为建立稻曲病菌Ustilaginoidea virens快速、灵敏的PCR早期检测技术,以S380为引物,对稻曲病菌和其它参试病原菌的DNA进行RAPD-PCR扩增。稻曲病菌RAPD特异片段经回收、克隆和测序后,根据序列用Primer 5.0软件设计了特异性SCAR引物US-SF（5’-TCGCCTCAGACCTCAATC-3’）/US-SR（5’-GAGCCTCAAATGCCTTCC-3’）和巢式PCR引物US-NF（5’-AGCGTCTCCTGCAACC-AC-3’）/US-NR（5’-GAGCCTCAAATGCCTTCC-3’）。利用引物US-SF/US-SR通过常规PCR对供试稻曲病菌均可扩增出1条大小约257 bp的清晰条带,对其它植物病原菌DNA的PCR产物均无扩增条带,最低可检测到1 pg/μL 的病菌基因组DNA;而利用引物US-SF/US-SR和US-NF/US-NR通过巢式PCR可从10 fg/μL的病菌基因组DNA中扩增出1条大小约210 bp的特异性条带。试验表明,巢式PCR检测灵敏度比常规PCR提高了100倍,且巢式PCR可从接菌的水稻幼颖和自然感染的谷粒中检测出稻曲病菌。     

水稻上三种条斑病细菌DNA的多态性初析

 试用40个引物对我国水稻条斑病菌、"稻短条斑病菌"和李氏禾条斑病菌等14个代表菌株进行RAPD分析,其中11个引物的扩增产物表现明显的多态性,共扩增出158条谱带,多态性为89.74%。聚类分析结果显示14个菌株可区分为3个类群,第1群包括LLS2、LLS3、LLS4、RS05、R1008、TAS和TAX;来自不同稻区水稻条斑病菌的群体结构差异明显,分属于第2群(如RS-Hai等)和第3群(如RS105等)。菌株DNA-RAPD指纹分析和致病性测定结果证明:李氏禾条斑病菌、"稻短条斑病菌"在水稻和李氏禾上不仅可相互侵染,而且遗传背景的相似性较高,确认是同一种病菌,其与小麦黑颖病菌亲缘关系较近,但与水稻细菌性条斑病菌具有明显差异。     

水稻白叶枯病菌单细胞系毒力分化研究

 以稀释倒平板法从0型菌086和IV型菌967-4和9620中分离到59个单细胞系;在12个近等基因系品种上,086和其单细胞系表现为弱毒力,2个IV型菌及其单细胞系能克服抗病基因Xa-1、2、3、8、10、11、14的抗性,不能克服Xa-21、4、5、7、13的抗性;带主效抗病基因的品种Asominori、XM5、M41、XM6和丰锦能把3个母株的59个单细胞系区分为12种数量差异或质量差异的不同致病型;将此5品种与近等基因系配合,适合作为病菌致病基因变异频度监测的寄主;采用"段叶沙培,切口取菌胶"法分离病菌,在中国致病型鉴定品种上划分的致病型,是田间病菌群体毒力结构的表型反应。     

木质部次生细胞壁增厚参与疣粒野生稻对黄单胞杆菌水稻变种的抗性

 黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是一个世界性的严重病害。疣粒野生稻（Oryzae meyeriana）对Xoo具有高度抗性,但其抗性机制仍不清楚。本文以抗病的疣粒野生稻和感病的水稻品种大粒香为材料,研究了Xoo侵染对叶片病斑、叶绿体超微结构、光合系统活性和木质部超微结构的影响。结果表明,多种Xoo生理小种导致的疣粒野生稻叶片病斑长度都明显短于大粒香叶片的病斑长度。Xoo病菌侵染显著破坏了大粒香的叶绿体结构,明显抑制了其光合活性,而疣粒野生稻中的变化要轻得多。通过电镜切片,发现疣粒野生稻叶片导管内存在大量的Xoo病菌,这表明Xoo能够侵染疣粒野生稻且能够在叶片内增殖。病菌的侵染诱导了疣粒野生稻木质部次生细胞壁的增厚,抑制了病菌通过导管纹孔向邻近细胞的进一步侵染,这种反应可能参与了疣粒野生稻对Xoo的抗性。     

hrp基因关键调控因子HrpG在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)在非寄主烟草上产生过敏反应(HR)和在寄主水稻上具有致病性,是由hrp致病岛决定的,其中HrpG为关键调控因子。Xoo和Xoc侵染水稻途径和在水稻上产生病害症状的不同,是否与hrpG基因有关,还不清楚。本研究利用反向遗传学方法获得了Xoo和Xoc的hrpG突变体PΔhrpG和RΔhrpG,并用hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因分别互补上述2个突变体,获得了相应的互补菌株。致病性测定结果显示,PΔhrpG和RΔhrpG突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生HR的能力,而hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因可分别互补上述突变体至野生型水平。利用GUS报告基因检测基因启动子活性发现,hrpG_Xoo和hrpG_Xoc的启动子活性没有显著差别;RT-PCR和Western杂交结果显示,hrpG基因交叉互补菌株中HrpG调控的下游基因hrpX、hpaR、hrcT、hpa2和hrpD6的表达没有差异,且III型分泌系统分泌蛋白Hpa2的分泌性没有受到影响。这些结果表明,稻黄单胞菌hrpG基因可在Xoo和Xoc中交叉互置,位于其上游和下游的调控途径可能相似,而决定Xoo和Xoc在水稻上的侵染途径以及所致病害症状差异可能与hrpG基因位点无关。     

云南水稻白叶枯病菌生理小种初析

从云南省 5个地州14个县市的水稻白叶枯病标本中分离水稻白叶枯病菌菌株 ,选择具有区域代表性的菌株 5 1株 ,利用已知抗病基因的近等基因系 ,在孕穗期应用剪叶法接种明确其生理小种。鉴定结果表明 ,云南省水稻白叶枯病菌小种复杂多样 ,共有 14种类型 ,暂定为YN1～YN14 ,优势生理小种为YN3、YN8、YN11,其中YN3分布在红河、德宏等 4个县市 ;YN8小种分布在大理等地区 ,小种的分布可能受地理区域的影响     

Growth of Glucose-uptake-deficient Mutant of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Rice Leaves

We isolated Xanthomonas oryzae pv. oryzae mutants deficient in the phosphoenolpyruvate : carbohydrate phos-photransferase system, a major glucose transport system in bacteria, using the glucose analogue 3-deoxy-3-fluoro-d-glucose (3FG). Glucose uptake by the mutants was decreased to 15–35% of the parental strain, and growth greatly decreased in synthetic media containing glucose as a sole sugar source. Growth of the mutants in rice leaves was, however, similar to the wild type. These findings suggest that glucose is not necessarily a major carbohydrate source for X. o. pv. oryzae in rice leaves. Received 11 August 2000/ Accepted in revised form 15 December 2000     

中生菌素对水稻白叶枯病的防治机制

对不同白叶枯病抗性水稻品种用200μg/ml中生菌素55℃温汤药液浸种，自然降温，秧田3—4叶期和移栽前5d各用30μg/ml中生菌素处理后，于成株期剪叶接种白叶枯病菌。结果表明中生菌素前期处理，于成株期接种白叶枯病菌时，高抗、中等抗性和感病品种中过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶3种酶活性都有不同程度的提高，且以中等抗性品种酶活提高最多，接种24和48h，3种酶活性较清水对照分别增加26．92％、26．74％、24．06％和7．09％、1．31％、1．60％。盆栽试验表明，中生菌素对中抗品种的防治效果最好，达58．4％。说明中生菌素对水稻防御酶活性的诱激作用是其防治白叶枯病的机制之一。     

稻白叶枯病菌外泌蛋白激发子的活性测定及其纯化

采用(NH4)2SO4分步沉淀法,从水稻白叶枯病菌的培养液中分离到具有激发子活性的物质。该蛋白处理水稻,可使水稻体内与抗病性相关的苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性显著提高;在田间喷洒水稻叶片,可以显著提高水稻对白叶枯病菌的抗性,病斑长度明显降低。经滚动式等电聚焦电泳和离子交换层析分离,生测结果表明第II吸收峰具有生物活性;再经SDS PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,第II吸收峰收集物有明显的一条带,相对分子质量为47 9kD。     

中国水稻白叶枯病菌毒性变异研究

 利用13个含已知抗病基因的近等基因系材料,在水稻孕穗期采用剪叶接种法对我国285个水稻白叶枯菌株(其中108个采集于1970~1992年,177个采集于2003~2004年)的致病力变异进行研究。结果表明,病菌的致病力呈现多样性。通过试验系统比较了不同时期病菌的毒性和小种组成变化。在此基础上对病菌群体毒性变化的原因进行了分析。     

水稻白叶枯病菌及其毒素引起烟草叶片组织坏死机制的研究

 水稻白叶枯病菌JXO Ⅲ细胞悬浮液及其分泌的毒素溶液接种到烟草叶片中,都能在烟草叶片上产生快速的坏死反应。引起坏死反应所需的最短时间分别为接种后8 h和0.5 h。低浓度的JXOⅢ(< 107 cfu/ml)接种后36~48 h内形成褪绿斑,而低浓度的毒素(< 2.5 mg/ml)接种后随时间延长在接点无任何可见变化。依文斯蓝(Evans blue)染色发现,毒素和JXOⅢ分别在接种后0.5 h和6 h内细胞大量死亡。叶圆片法测定表明,接种毒素后2 h内烟草细胞膜透性迅速上升,接种JXOⅢ后9 h细胞膜透性开始明显上升。毒素处理的烟草叶片中LOX、POX、SOD、CAT活性水平较对照降低,而JXOⅢ处理中上述酶活性较对照有不同程度的增加。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺,RNA合成抑制剂放线菌素D和钙离子通道阻断剂氯化镧分别以7.1×10^-5 M、1×10^-4 M和1×10^-3 M浓度有效地抑制JXOⅢ在烟草上形成坏死反应,这些抑制剂对毒素在烟草上的坏死反应则没有影响。