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SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库 总被引:2,自引:0,他引:2
为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5~2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。 相似文献
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利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库 总被引:1,自引:0,他引:1
SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行。经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106cfu.mL-1,重组率达93.3%,全长率为59%。插入片段大小多在1.0~2.0kb,所占比例为70%,平均大小在1.1kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu.mL-1,可用于长期保存。 相似文献
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策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5~2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。 相似文献
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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签(EST),序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。 相似文献
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为了探索甘蓝胞质雄性不育的分子机制并研究花药发育相关重要基因编码蛋白质间的相互作用,采用SMART技术与同源重组方法,在酵母菌株Y187中构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)Ogura细胞质雄性可育保持系‘463’为试验材料,混合其不同生长时期的花蕾,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与线性载体质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母菌Y187中,二者利用酵母细胞内较高的同源重组酶活性,在酵母体内进行同源重组产生有复制活性的环形文库质粒,然后在缺亮氨酸(LEU)培养基板上筛选出所有克隆,成功构建了甘蓝花蕾酵母双杂交cDNA文库。经检测,cDNA文库的转化率为1.20×108转化子/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为1.85×109 pfu/mL,重组率大于95%。该文库容量为4.5×106cfu,理论上包含了甘蓝花蕾发育相关的所有基因。 相似文献
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以‘闽花6号’品种为材料,利用SMART技术成功构建了花生叶不同生育时期混合的全长c DNA文库,并对文库的部分序列进行测序及分析.结果表明,该文库原始库容为2.25×106cfu·m L-1,重组率达100%,插入片段大小为750-2000bp,平均插入片段大小为1000 bp,达到文库质量要求.随机挑选50个单克隆进行5'端测序,共获得50条有效序列.通过与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因25个,未知功能基因14个,新基因11个,其中49个(98%)基因为花生未报道的基因.参与代谢过程和胁迫响应的基因表达量较高. 相似文献
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采用SMART技术,以多花水仙‘黄花水仙2号’盛开期花朵为材料,构建其全长cDNA文库,并对文库质量进行鉴定.结果表明,所构建初始文库的滴度为6.30×10^5 cfu·mL^-1,扩增后文库的滴度为1.58×10^8 cfu·mL^-1,重组率为84%,插入片段大小集中在500-2000bp之间,平均长度约970bp,符合eDNA文库的质量标准.可见,所构建的文库比较完整,能够反映黄花水仙花朵盛开期基因的表达情况. 相似文献
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采用ZAP Express cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit试剂盒,构建了小菜蛾(Plutella xylostella)的全长cDNA文库.利用TRIzol试剂盒提取小菜蛾成虫总mRNA,通过Oligo试剂将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA产物为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得小菜蛾cDNA原始文库,其滴度为1.5×106pfu.mL-1.扩增后的cDNA文库的滴度为1.4×1010pfu.mL-1.取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取20-25个独立噬菌斑,用M13±通用引物PCR扩增后,测得文库的重组率大于95%,插入cDNA片段的长度平均为1.25 kb.该文库的构建,可为小菜蛾抗药性基因的相关研究提供一个平台. 相似文献
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水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350~2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。 相似文献
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