SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析.结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1 μmol/L和50 ng/μL.最佳PCR反应程序为:94℃预变性30 s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30 s,72℃延伸40 s,最后加做熔解曲线82℃1 s.结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因.本研究成功建立了2-△△CT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究.     

SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

獐茅AIHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因,根据已克隆的AIHAK1及β-actin碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价.结果表明AIHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数<5%.所建立的A1HAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AIHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AIHAK1农作物的检测奠定了方法学基础.     

獐茅AlHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

本研究以β-actin为内参基因,根据本实验室克隆的AlHAK1及β-actin 碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价。结果表明AlHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数< 5 %。所建立的AlHAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AlHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AlHAK1农作物的检测奠定了方法学基础。     

广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR-PCR反应体系,以广东紫珠总DNA为试验材料,通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度和Taq酶用量进行优化,确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0.25 mmol/LdNTPs、1.00 U Taq DNA聚合酶、0.75μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg²⁺、100 ng模板DNA,总反应体积为25μL。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火温度与每个引物相对应,退火45 s;72℃延伸90 s;34个循环;后72℃延伸10 min;4℃保存,扩增结束。用来自不同居群4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的20个引物。     

山杏RAPD反应体系条件的优化

以山杏新鲜叶片为材料,研究了山杏RAPD分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合山杏RAPD反应的PCR体系,即20μL反应体系中含有Taq酶1.0U、Mg2+ 2.0mM,四种dNTP各0.1mM,引物0.5μM,模板DNA50ng。扩增程序为：94℃预变性4mins;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1.5mins,10个循环;94℃变性30s,36℃退火40s,72℃延伸60s,30个循环;最后72℃延伸5min     

胡椒SRAP反应体系的建立和优化

建立并优化胡椒SRAP分子标记体系,为海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析、物种和品种鉴定等打下技术基础。利用单因素随机试验对胡椒SRAP-PCR反应体系中各组分（Taq DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、引物和Mg2+）的浓度进行优化,同时筛选SRAP-PCR反应的循环数和最适退火温度。通过实验确定了SRAP-PCR反应体系为：反应总体系为20 μL,其中引物0.35 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,dNTP 0.6 mmol/L,Mg2 + 1.5 mmol/L,模板DNA 25~200 ng,同时通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度;最佳SRAP-PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,35℃退火30 s,72℃延伸45 s,5个循环;然后94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。SRAP-PCR体系适为胡椒属植物遗传多样性分析奠定了基础,并成功地应用于海南胡椒属植物亲缘关系和遗传多态性分析。     

小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。     

枣树RAPD分析体系优化研究

利用随机引物扩增多态性(RAPD)分子标记技术研究不同枣树品系之间遗传多态性,建立起一个基于PCR技术的分子遗传标记RAPD分析的优化体系.设置不同的浓度梯度,从dNTPs、随机引物、Taq酶、Mg2 、缓冲液Buffe,的浓度及模板DNA的质量和用量方面考察,建立了枣树RAPD技术最优体系.结果表明:20μL反应体系组分含量为10×Taq酶Buffer 2μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.06 U/μL,DNA模板浓度1.5 ng/μL.最佳扩增程序为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,36℃退火40 s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸8 min.     

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

花吊丝竹ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。     

叶用莴苣荧光定量PCR体系的优化

为建立一套最适合叶用莴苣(Lactuca sativa L.)基因表达量研究的荧光定量PCR技术体系,以叶用莴苣S24为试材,采用SYBR GreenⅠ法,利用叶用莴苣内参基因的2对引物组合18SR1和18SR2,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下进行扩增反应。结果表明,分别在10 μL和20 μL反应体系条件下内参基因引物组合18SR1的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标都优于内参基因引物组合18SR2;2对内参基因引物组合18SR1和18SR2在10 μL反应体系中的扩增曲线、标准曲线以及溶解曲线等指标也均优于20 μL反应体系。因此叶用莴苣荧光定量PCR内参基因利用18SR1引物组合,反应体系采用10 μL比较合理。     

瘤胃脂肪分解菌实时荧光定量PCR方法的构建

为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S r DNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与PMD19-T Vector连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。     

巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材,对影响ISSR-PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg2+,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选.确立了适合刺梨ISSR-PCR分析的最佳反应体系,即20 μL反应体系中各组分浓度分别为:10×buffer2.0 μL,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,dNZPs0.1 mmol/L,引物2.μ mol/L,模板DNA20ng.PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性1 min,48℃退火温度45 s,72℃延伸1 min,34个循环,72℃后延伸6min.利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测,结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好.     

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16(44)正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序.在15μL体系中各反应的最适合含量为:50ng模板DNA,240μmol/L dNTP,0.4μmol/L SSR引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,1.5μL 10×PCR Buffer,2.5mmol/L MgC12.PCR适宜扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性30 s,52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃.同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对.用于鸭茅SSR标记的进一步研究.     

实蝇RAPD反应体系的构建与优化

以几种常见的实蝇为材料，研究了实蝇RAPD分析过程中的影响因素，包括模板DNA浓度、dNTP、引物、Taq酶、变性时间、循环次数、退火温度等，建立了适于实蝇RAPD分析的PCR反应体系：在25μl反应体系中，模板DNA用量为80ng，MgCl 2浓度为2.0mM；四种dNTP浓度各为0.2 mM；Taq引物浓度为0.5μM；酶用量为1U；扩增程序：先94℃预变性3min，再94℃变性45s、36℃退火1min、72℃延伸2min共40个循环，最后延伸10min。     

三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测方法

为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。