桂林进口香石竹苗检测出香石竹病毒

我们对桂林动植物检疫所送检的来自日本熊本市的5个香石竹品种进行奥氏双扩散测定,抗血清为香石竹斑驳病毒(CaMV),环斑病毒(CaRv),潜隐病毒(CaLV),坏死斑病毒(CaMV),脉斑病毒(CaVMV)的5种抗血清(由英国温室作物研究所 A.A.Brunt 博士提供),其中4个样品与 CaMV 抗血清有阳性反应,5个样品均与 CaNFV 抗     

番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的兔多克隆抗体,用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好2条病毒检测线（T线）和1条羊抗兔抗体质控线（C线）,制成复合型免疫层析检测试纸条。一张试纸条在10min内,可同时检测出这两种病毒。试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg/mL,试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的混合病汁液可稀释1000倍（重量/体积）。用健康叶片和缓冲液对照测试,试纸条结果都为阴性。     

一种新的适用于ELISA的抗血清纸片保存法

用特异性抗血清制备的抗血清纸片应用于酶联免疫吸咐实验（ＥＬＩＳＡ），取得了良好的结果。目前已将抗血清纸片用于南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）、番茄环斑病毒（ＴｏｍＲＳＶ）、烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）、南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）等进境植物危险性病毒的检测，取得与使用冻干保存抗血清相同的效果。应用抗血清纸片方便、经济、便于保存和邮寄。     

DAS—ELISA检测香石竹环斑病毒

使用碱性磷酸酶标记的抗体进行DAS－ELISA试验，检测香石竹环斑病毒的灵敏度可达4ng/ml的提纯病毒或10^-4倍稀释的克利夫兰烟的病汁液。在检测人工接种的Dianthus spp.的5个品种时，有2个品种在接种7天后还没有表现症状，但DAS－ELISA检测为阳性反应。     

香石竹环斑病毒的分子检测

试验具体研究了两类不同性质的ｃＤＮＡ探针对香石竹环斑病毒的检测效果。毒源由中国农业大学植物病毒室提供，繁殖于苋色藜Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍａｍａｒａｎｔｉｃｏｌｏｒ上，提纯该病毒，然后抽提其核酸ＲＮＡ，将ＲＮＡ多聚腺苷化后，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，反转录合成ｃＤＮＡ，补平后与载体连接，转化大肠杆菌，获得阳性克隆，用３２Ｐ和光敏生物素分别标记ｃＤＮＡ制作探针，与ＣＲＳＶ及其ＲＮＡ进行点杂交，结果表明，两类不同性质的探针在检测ＲＮＡ水平上具有相同的灵敏度，其检测极限均达到１ｎｇ／ｍｌ，并对二类探针进行了比较。     

A蛋白碱性磷酸酯酶的标记及酶联测试

以戊二醛为交联剂,采用两步法将Ａ蛋白及碱性磷酸酯酶标记,获得的酶标记物可稀释１／２０００,酶联对香石竹斑驳病毒,马铃薯Ｘ病毒、南方菜豆花叶病毒,烟草环斑病毒的提纯制剂及病汁液检测,分别达到２０ｎｇ和稀释１０＾－２￣１０＾－５。而阴性对照维持在较低的水平。     

实时荧光RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CymMV）是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

引进加拿大马铃薯种薯中病毒的检测

应用酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）对2000年种植于网室和田间隔离种植地的引进加拿大马铃薯种薯3个品种进行马铃薯黄矮病毒、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯Y病毒N株系（PVY^n）、马铃薯黑环斑病毒、烟草脆裂病毒、马铃薯X病毒和马铃薯S病毒（PVS）的检测。对网室样品中经ELISA检测怀疑为阳性样品再用组织超薄切片、直沾法和免疫电镜法制备电镜检样品做电镜观察。结果在网室的Russet Burbank品种上检出PVA和PVS，其它两品种检出PVS；田间隔离种植中检出PVY^n和PVS。     

三种外检植物病毒的灭活处理

番茄环斑病毒（ＴｍＲＳＶ），烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ），南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）的病汁液和ＰＥＧ粗提纯液，经适宜温度或甲醛处理，均丧失侵染性而有抗原性。ＴｍＲＳＶＰＥＧ粗提纯液经６０℃（水浴）处理１０分钟或２８℃７天，ＴＲＳＶ粗提纯液置２５℃一个月，Ａｒ－ＭＶ在４０℃７天条件下均可做为阳性对照的灭活处理的最佳方案。可保存抗原性在７～１２月以上。为了防止危险性检疫病毒的侵入，对入境种苗进行检疫，需建立快速、准确、标准化检疫程序，而在血清学快速诊断试验中，提供阳性对照，对提高判断准确率是必要的。因此，为了解决在诊断试剂中提供阳性对照但又不能使其检疫性病毒人为扩散这一重要问题，我们在研究三种外检病毒（ＴｍＲＳＶ，ＴＲＳＶ，ＡｒＭＶ）的检验技术的同时，又进行了一些灭活试验，用化学和物理方法钝化病毒，使其失去侵染性而保持抗原性，并应用于酶联诊断试剂盒中，本文报道了初步试验结果     

检测兰花病毒的斑点酶联法的建立

本文建立了齿兰环斑病毒（Odntoglossum ringspot virus,ORSV）和建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）两种兰花主要病毒的斑点酶联法检测技术（Dot-ELISA）。用Dot-ELISA对提纯病毒和田间病叶进行检测,结果表明;检测ORSV和CyMV提纯病毒的灵敏度分别为0.82μg/mL和0.244μg/mL;病叶汁液的稀释倍数分别为1280倍和2650倍。该方法具有操作简便、成本低等优点,适合于兰花生产中的病毒检测。     

侵染月季的李坏死环斑病毒的检测及CP基因序列分析

近年来，随着我国切花月季（Rosa hybrid）种植面积的不断增加，月季病毒病的发生日趋严重。据笔者调查，平均发病率20％～30％，有的品种如“绿宝石”，发病率超过60％。李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV）是月季的主要病毒之一。国内对月季病毒病的研究较少。为明确我国切花月季的主要病毒种类，加强对月季种苗质量的监督检测，笔者对侵染月季的PNRSV云南分离物（PNRSV—yunnan）进行了CP基因克隆及序列分析，建立了快速RT—PCR检测技术。     

萝卜花叶的病毒类羣和复合病侵染的研究初报

北京郊区的蘿卜花叶往往是蕪菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒,以及一种环斑病毒的复合病。这种环斑病毒在蘿卜上产生花叶;但在心叶烟上产生环斑,逐渐在心叶烟上会复元而带病的。可注意的是从蘿卜上分离的黃瓜花叶病毒和环斑病毒单独不能侵染蘿卜白菜。初步試驗这两个病毒能和蕪菁花叶病毒混合汁液接种时才侵入十字花科植物。     

番茄环斑病毒研究进展

50多年的研究表明:番茄环斑病毒(Tomato Ringspet Virus-ToRSV),是线传病毒组成员,寄主范围广,包括105属157种草本和木本植物,分布也很广,到目前已有27个国家报道过这种病毒,主要是在果树和浆果作物上引起严重的病害,北美尤为严重。1936年,Price 最早从烟草幼苗上分离到这种病毒,并对它的生物学特征作了描述,和烟草环斑病毒在寄主范围和症状表现上都很相似,最初定名为烟草环斑病     

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

香石竹环斑病毒的提纯及抗血清制备

选用豇豆黑种三尺作繁殖寄主,接种４周后采收病叶,采用聚乙二醇沉淀,差速离心和１０～４０％蔗糖梯度离心,得到提纯的香石竹环斑病毒,紫外吸收呈典型核蛋白吸收曲线,电镜下见到大量球状病毒粒体。采用多种途径免疫家兔获得的抗血清,琼脂双扩散测得效价为１∶１６     

实时荧光RT-PCR方法检测香石竹环斑病毒

 本研究以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus, CRSV)的5个分离物为研究对象,根据CRSV运动蛋白（MP）基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了检测CRSV 的实时荧光RT-PCR（real-time fluorescent RT-PCR）方法。该方法利用TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现real-time fluorescent PCR扩增和检测同步进行。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法具有更快速、灵敏和特异的优点,与普通RT-PCR方法相比其灵敏度提高了100倍,适合于对进境种苗携带的CRSV的快速检测。     

香石竹斑病毒的提纯及抗血清制备

选用缸豆黑种三尺作繁殖寄主,接种４周后采收病叶,采用聚乙二醇沉淀,差速离心和１０－４０％蔗糖梯度离心,得到提纯的香石竹环斑病毒,紫外吸收呈典型核蛋白吸民一,电镜下见到大量球状病毒粒体。采用多咱途径免疫家兔获得的抗血清,琼脂双测得效价为１：１６。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

韩国首次报道蓝莓红环斑病毒侵染蓝莓

蓝莓红环斑病毒(Blueberry red ringspot virus,BRRSV)属Caulimovididae科大豆萎黄(退绿)斑驳样病毒属(Soymovirus),引起蓝莓(Vaccinium corymbosum)叶、茎和果的红环斑病。美国、日本、捷克、斯洛文尼亚、