口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病菌（FMDV）（L1-L5）的RNA，用1对通用引物经RT-PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段，克隆后通过测序获得其核苷酸序列，分析表明，除L2株外，其余4株（L1，L3，L4和L5）VP1基因的核苷酸序列同源性在96.7%-99.8%。氨基酸序列同源性在99.5%-100%；而L2株与L1，L3，L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82.0%-83.4%，氨基酸序列同源性在89.7%-90.1%,L1,L3,L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86，HKN/1/99，HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在85.0%-99.8%，属于同一基因型；而与L2，F29/CHINA及国外大多数毒株相比，属于不同的基因型，其核苷酸序列同源性仅为41.0%-82.6%，5株毒株中的L1，L3，L4和L5的主要中和抗原位点140-160，200-213位氨基酸序列完全相同，推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB、3A基因的克隆与原核表达

以构建的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC质粒pGEM-T-3ABC为模板,设计了特异性的引物,进行RT-PCR扩增得到非结构蛋白3AB、3A基因,然后分别定向克隆到原核表达载体pET-28a、pET-41a载体上,将重组质粒转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,证明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

C型口蹄疫病毒鼠源毒株3A基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR技术克隆获得了一株C型口蹄疫病毒鼠源毒株的非结构蛋白3A基因(C-3A),并对其进行序列测定及分析.结果表明,C-3A编码全基因序列中核苷酸共435 bp,编码氨基酸145个;与12株参考毒株比较发现,C型毒株核苷酸序列在第274~297位发生了缺失,氨基酸在92~99位发生缺失.核苷酸的同源性比较显示,C-3A基因与YNBS/58-3A基因的同源性最高,为82.8%;C-3A基因与TW/97-3A基因的同源性最低,为72.5%.氨基酸的同源性比较表明,C-3A基因与OIC/58-3A基因的同源性最高,为86.9%;与TW/97-3A基因的同源性最低,为72.7%.     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

口蹄疫病毒 VP1与3ABC 基因片段的克隆及表达

根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV) VP1和3ABC 基因序列,设计了2对引物. 采用RT-PCR方法从FMDV分离株O/HK/2001扩增得到 VP1和3ABC 基因. 经对它们的核苷酸序列测序和同源性比较,显示与14株O型FMDV参考毒株中的O/HKN/2002同源性最高(分别为98.3%和98.6%),并且在 VP1决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定族的144、148、154和208位     

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定

用E.coli原核表达并纯化的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)非结构蛋白3B免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA筛选出分泌鼠IgG的杂交瘤细胞株,将该杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水,用间接ELISA法筛选获得6株能稳定分泌抗3B蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2、8B11.鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达90%以上,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1:100 000以上;6株单抗均不与FMDV结构蛋白VP1和3D非结构蛋白发生反应;间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能够识别3B蛋白;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定.     

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白,根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET28a,构建原核表达质粒pET28a C160,并将重组质粒转化BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导后,收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示,在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带,且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白全部以包涵体形式存在,经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗,免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

口蹄疫病毒Akesu/58持续感染分离株P1基因的克隆及序列分析

以持续感染模型动物牦牛的食道/咽部分离物(O/P液)为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了P1结构蛋白基因的全序列。序列测定和分析结果表明,持续感染分离株的序列与Akesu/58参考毒株的序列相比,其同源性为86.5 %,而与china/99的同源性高达89.4 %。氨基酸差异分析表明,氨基酸相应的密码子中T-C或A-G互变频率较高,这可能是导致氨基酸改变的主要因素。     

转亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因烟草研究

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析

应用RT PCR和nPCR实现了口蹄疫病毒O/PanAsia/10株的全衣壳基因的克隆和序列测定.对核苷酸和氨基酸的序列分析表明,与经典O型毒株比较存在较大变异.其中4种结构蛋白的变异顺序是VP1>VP3>VP2>VP4.P1基因G+C值约55%.全衣壳蛋白相对分子质量约8 0×104.主要结构蛋白VP1呈碱性,等电点约9 5.     

猪口蹄疫病毒对三种动物细胞嗜性的研究

将猪FMDV毒株(O/GD/MSH/86)分别适应牛肾细胞(Bovinekidney,MD-BK)、幼仓鼠肾细胞(Babyhamsterkidney,BHK-21)和猪肾细胞(Porcinekidney,PK-15),研究了FMDV在宿主细胞上的嗜性。结果发现,该毒株在MD-BK细胞上不产生细胞病变(CPE),从细胞液中也未检测到病毒,而在BHK-21和PK-15细胞上能够稳定产生CPE。可见,猪FMDVO/GD/MSH/86毒株不能在MD-BK细胞上增殖,而在BHK-21和PK-15细胞上则增殖较好。     

口蹄疫病毒株AF72 P1的结构分析

对口蹄疫病毒AF72株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆,并采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布.结果表明:FMDV AF72株P1基因全长2211bp,包含完整的开放阅读框,编码737个氨基酸,其中,VP1长639bp,编码213个氨基酸,VP2长654bp,编码218个氨基酸,VP3长663bp,编码221个氨基酸,VP4长255bp,编码85个氨基酸.P1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,VP4上也有少量的潜在B细胞表位.