农杆菌介导的人白细胞介素-4基因转化甘蓝的研究

以结球甘蓝‘92-1012-3-11’自交系种子转白细胞介素-4(IL-4)基因T0代材料为试材,研究了通过农杆菌介导法将人IL-4基因导入甘蓝后代的遗传转化情况.结果表明:共得到抗草铵磷(PPT)抗性再生植株396株,聚合酶链式反应(PCR)阳性植株137株,其中带柄子叶转化率为8.1％,下胚轴分化率为5.8％.通过对转基因阳性株T0代的PPT抗性筛选、PCR、PCRSouthern杂交检测获得IL-4阳性甘蓝植株,表明IL-4基因已转入甘蓝受体中.经ELISA和Western检测,说明IL-4基因已整合到甘蓝基因组,但表达量很低(0.23～2.81 ng/mL),且各植株间的表达量差异极大.     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用

从甘蓝原始材料７９－３９９的自然群体中获得雄性不育突变株７９－３９９－３。研究结果表明，该突变株的雄性不育受一显性不育基因ＣＤＭｓ３９９－３控制。该基因在不同的遗传背景下表现为环境敏感和环境稳定两种类型，且温度是影响不育稳定性的主要因素。环境敏感的显性雄性不育植株通过自交可以得到显性纯合的雄性不育植株。显性纯合不育植株与普通自交系或相应的姊妹系杂交获得了不育株率达到１００％、不育度达到或接近１００％的不育群体。根据ＣＤＭｓ３９９－３基因的这一遗传特点，建立了利用显性雄性不育基因配制甘蓝杂交种的新方法：利用组织培养技术保存和繁殖显性纯合雄性不育材料，然后与遗传差异较小的普通自交系或姊妹系杂交得到不育系。选择园艺性状优良、不育性稳定的不育群体作不育系，与配合力优良的自交系杂交，配制出了优良的杂交组合。试验采种结果表明，携带ＣＤＭｓ３９９－３基因的甘蓝雄性不育系结实性状优良     

芸薹属SSR引物在甘蓝分子育种中通用性的研究

利用SSR技术对甘蓝进行分子生物学研究,对影响其扩增效果的指标Mg~(2+)和dNTP进行筛选优化,获得了适宜甘蓝(C基因组)SSR的PCR条件。将已公布的在芸薹属不同作物上开发的78对引物运用于随机筛选的3株甘蓝材料上。结果表明:在78对芸薹属引物中,11对引物在3株甘蓝材料上表现良好的差异性,5对引物则表现无差异但是所得条带清晰。试验结果为进一步开展甘蓝分子育种奠定了基础。     

转il-4基因甘蓝后代的遗传及表现分析

利用农杆菌介导法将il-4基因转入甘蓝品种"中甘11",用已转化得到的T3、T4代甘蓝品种为试验材料,通过PCR扩增、PCR-Southern杂交、蛋白质浓度测定和ELISA技术,对il-4基因转化甘蓝的后代进行了检测,并对il-4基因在T3、T4代甘蓝中的传递规律以及后代甘蓝植株的田间表现进行了调查。结果表明:T3、T4代转il-4基因甘蓝阳性植株数较少,甘蓝中il-4基因出现性状分离。同时,田间调查表明,相对于对照组(非转基因)植株,转il-4基因阳性植株的田间抗病性下降,植株高度降低,结实率降低,单株结籽数减少,生长势等农艺性状降低。     

2014年度国家科学技术进步奖二等奖——“甘蓝雄性不育系育种技术体系的建立与新品种选育”

<正>2015年1月9日,国家科学技术奖励大会在人民大会堂举行。由中国农业科学院蔬菜花卉研究所方智远院士主持完成的"甘蓝雄性不育系育种技术体系的建立与新品种选育"荣获2014年度国家科学技术进步奖二等奖。为克服甘蓝自交不亲和系杂交制种中易出现假杂种、亲本繁殖需人工授粉成本高等弊端,方智远带领甘蓝课题组成员,历经多年从30多万株种株中发现了甘蓝新型雄性不育源79-399-3,经研究阐明其不育性为显性核单基因控制,并从其自交后代中选育出纯合不育株,利用分子标记辅助选择技     

甘蓝NLR家族全基因组鉴定、进化分析及在不同病害胁迫下的表达分析

从全基因组水平鉴定了87个甘蓝NLR基因家族成员,并对其进行了进化分析和表达分析。基因结构和motif组成分析表明,87个基因可分为5个亚类:NB-LRR(34个)、CC-NB-LRR(6个)、TIR-NB-LRR(45个)、RPW8-NB-LRR(1个)和CC-TIR-NB-LRR(1个);染色体定位分析表明,该家族基因在9条染色体上呈不均匀地单一或成簇分布;进化分析表明,甘蓝35个NLR基因与白菜NLR基因存在同源关系,其余52个基因为甘蓝特有;利用转录组数据分析了参与甘蓝枯萎病、黑腐病、根肿病、霜霉病、白粉病等抗性应答相关的差异表达基因,发现参与不同病害胁迫抗性应答反应的NLR基因差异较大,这可能与不同NLR基因对不同病原特异性识别有关。     

结球甘蓝BoCBF1与BoCBF2基因的CAPS标记及其对耐寒性的影响

以两份具有不同耐寒性的甘蓝自交系341和21-3为试材,根据已有拟南芥CBF1基因序列及甘蓝基因组测序拼接出的Scaffold信息,获得了甘蓝BoCBF1和BoCBF2基因编码区的全长序列。经PCR产物直接测序发现BoCBF1基因在自交系341和21-3间的变异表现为4个单核苷酸多态性（SNP）,而BoCBF2基因则表现为16个SNP及1个18 bp碱基的插入缺失（InDel）。为简便快捷地鉴定两个自交系间BoCBF1和BoCBF2基因序列的变异,开发了BoCBF1和BoCBF2基因的CAPS标记,分别命名为BoCBF1-TaqαⅠ和BoCBF2-BstUⅠ。利用这两个CAPS标记对两个自交系、F1、F2群体的基因型与耐寒性进行相关性分析,发现这两个基因的变异与材料的耐寒性极显著相关,可用该标记进行甘蓝耐寒育种的分子标记辅助选择。     

两个甘蓝CBL基因的基因组解析

利用比较基因组学的方法从甘蓝基因组中鉴定出两个CBL基因,并对其结构、遗传进化、顺式元件进行了分析,以期为进一步研究这两个基因的功能和利用它们进行甘蓝抗逆分子育种提供有益借鉴。     

大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定

 以大白菜(B．campestris ssp．pekinensis)‘北京80号’生长3 d无菌苗的带柄子叶为外植体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法导人马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pinⅡ)。通过抗性株的真叶在不定芽诱导培养基上的再生， 证实了嵌合体的存在，并通过此方法来消除嵌合体。获得的转基因植株经PCR、PCR-Southern杂交以及植物基因组Southern杂交证实，目的基因已经整合入植物基因组中。对菜青虫(Pieris rapae L．) 进行了转基因大白菜叶片的连续离体饲喂，结果表明：受试的转基因大白菜对菜青虫的生长发育有较明显的抑制作用。     

我科学家领衔破译白菜甘蓝油菜全基因组遗传密码

由我国科学家领衔的白菜、甘蓝和油菜全基因组测序项目已取得阶段性重大成果,目前已获得白菜全基因组精细图,甘蓝和油菜全基因组框架图。研究表明,白菜、甘蓝和油菜的基因组大小分别约为5亿、6.5亿和11亿个碱基对,白菜和甘蓝含有的基因总数目分别约4.2万和4.5万个,油菜基因覆盖度85%以上。该项成果是国际上首次对三个近缘作物物种进行的整体测     

SSR标记遗传距离与结球甘蓝杂种优势的关系分析

利用SSR标记对23份春甘蓝自交系和29份秋甘蓝自交系进行遗传多样性分析,结果表明:春甘蓝自交系在遗传相似系数0.61处可以划分为极早熟和早熟2个类群。秋甘蓝自交系在遗传相似系数0.58处可以分为中晚熟群、中早熟群和中熟群3个类群。从上述材料中挑选15份代表性材料作为亲本,采用完全双列杂交法组配105个杂交组合,对其进行杂种优势分析,同时探究SSR分子标记遗传距离与杂种优势之间的关系。结果发现,不同类群间杂交或同一类群不同亚群间杂交产生的后代杂种优势较强,遗传距离与全株质量中亲优势的相关性达显著正相关,表明基于SSR分子标记划分的类群对于杂种优势的预测具有一定的价值。此外还发现,在105个杂交组合中,全株质量中亲优势最强的10个组合的组配方式均为春甘蓝×秋甘蓝,表明春甘蓝×秋甘蓝可能是一种潜在的杂种优势利用模式。     

我科学家领衔完成甘蓝基因组测序分析

<正>由我国科学家领衔的白菜、甘蓝和油菜全基因组测序项目取得阶段性重大成果:继白菜基因组测序项目完成后,科学家日前完成了甘蓝基因组测序和分析,并在此基础上与其他近缘种植物基因组比较,发现了作物种间和种内基因组呈现多层次不对称的进化规律。该研究成果近日在线发表在国际权威学术期刊《自然·通讯》上。据甘蓝项目组技术负责人、中国农科院油料研究所研究员刘胜毅介绍,甘蓝基因组至少包含45758个蛋白编码基因,与白菜基因组相似,其基因组的大部     

甘蓝PMEI家族基因结构、基因组分布和表达分析

为了弄清甘蓝PMEI家族基因成员数、基因结构和分布及其与自交不亲和性的关系,利用转录组测序和相关生物信息学方法对其进行了基因结构分析和全基因组鉴定,对家族基因进行了表达谱分析,并通过实时荧光定量PCR技术验证了基因的表达情况。结果表明,甘蓝中PMEI家族包含101个基因,分为11组,其成员不均匀分布在9条染色体上,主要通过全基因组三倍体复制(wholegenome triplication,WGT)和串联复制事件进行倍增,与拟南芥在1 556万年前发生分化。数字表达谱分析发现在101个基因中,BoPMEI56、BoPMEI54、BoPMEI32、BoPMEI29、BoPMEI78、BoPMEI30、BoPMEI57、BoPMEI58和BoPMEI84这9个基因在自花和异花授粉后表达趋势有明显差异。荧光定量PCR结果显示,其在自花授粉和异花授粉的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。这些结果表明:BoPMEI家族的101个成员中,可能至少有9个基因以不同方式参与调控甘蓝自花和异花授粉后的反应过程,可能与甘蓝自交不亲和性有关。     

基于叶球转录组数据比较的甘蓝杂种优势分析

对甘蓝两个杂交组合F_1的杂种优势进行了田间性状统计分析以及叶球转录组测序分析。所调查的9个园艺学性状中,单球质量和球主叶柄质量在F_1代及其亲本之间差异显著,其中单球质量的中亲优势和超亲优势在两个组合F_1中表现突出,即产量杂种优势较为明显。通过叶球转录组分析,分别筛选获得了4组差异表达基因,在相同标准下,两个杂交组合中父本与F_1代的差异表达基因明显多于母本与F_1代的差异表达基因,表明母本的表达谱与F_1更相似,即母本在F_1叶球杂种优势形成中的贡献较大,而且上调差异表达基因的差异倍数明显高于下调差异表达基因,表明上调基因在F_1代甘蓝叶球杂种优势建成中有重要作用。进一步将差异表达基因进行GO(Gene ontology)分类、COG(Cluster of orthologous groups of proteins)分类、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析以及可变剪接分析,发现差异表达基因显著富集到生长发育、碳水化合物转运和代谢、信号转导以及氨基酸的合成、转运和代谢等途径。随机选取7个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,结果与RNA-seq数据基本一致,证明转录组数据的可靠性。本研究中获得的与甘蓝叶球杂种优势形成相关的差异表达基因,为后续甘蓝杂种优势分子机制研究提供数据支持。     

Bt cry1Ia8抗虫基因对结球甘蓝的转化及其表达

 以结球甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata L. ) 的下胚轴和具柄子叶为外植体, 通过根癌农杆菌(Agrobacterium tum efaciens) 介导法将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 杀虫晶体蛋白基因cry1Ia8导入结球甘蓝中, 共获得38株卡那霉素抗性植株。PCR和Southern blot检测证实cry1Ia8基因已经成功导入并整合到甘蓝的基因组中; RT2PCR和Western blot检测表明, cry1Ia8基因在转录和翻译水平有一定的表达; 转化植株叶片离体饲喂敏感小菜蛾( Plutella xylostella) 和对Cry1Ac蛋白表现抗性的小菜蛾的试验表明, 该基因不仅对敏感小菜蛾有很强的抗性, 对抗性小菜蛾也具有较强的抗性。     

甘蓝与白菜种间杂交的双二倍体后代

作者利用胚培养法获得甘蓝与白菜种间杂种和杂种后代。有意义的是由幼胚发育成的胼胝体中获得双二倍体的后代。在本实验中对于杂种和双二倍体杂种后代所表现的性状和细胞学(染色体)的现象进行了观察和比较,并且对于甘蓝的基因组(CC)和白菜的基因组(AA)之间的亲合性(Affinity)作了一些探讨。     

采用胚挽救获得Ogura CMS甘蓝与甘蓝型油菜的种间杂种

为将甘蓝型油菜细胞质雄性不育系(Ogura CMS)的恢复基因转至甘蓝Ogura CMS材料上,以6份甘蓝Ogura CMS材料为母本,以含恢复基因的甘蓝型油菜为父本,人工杂交结合胚挽救培养,研究取材时期、培养基成分和杂交组合对胚珠成苗的影响,同时对胚挽救培养获得的植株是否为真实F1杂种进行鉴定。结果发现,胚珠培养以剥蕾授粉后16d取材时胚珠成苗数最多,成苗率为4.56%;培养基以MS+GA 0.1 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+0.5%水解酪蛋白(CH)+0.5%活性炭(AC)成苗效果最好,成苗率高达6.24%;M09CMS×RFO-46组合成苗数最多,成苗率为5.96%。67株胚挽救培养得到的植株经流式细胞仪、SSR分子标记和形态学鉴定,得出65株为真杂种,真杂种率高达97%。     

农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花

 用农杆菌介导法, 以茎段(节间) 为外植体, 将含有苏云金芽孢杆菌(Bt) 毒蛋白Cry1Ac基因的植物遗传载体导入菊花(切花菊) 品种‘日本黄’中, 得到126株抗性植株, PCR检测及基因组DNA的Southern杂交分析表明Cry1Ac基因已整合到菊花总DNA中, 共获得6株转基因植株。利用棉铃虫做转基因植株的盆栽和叶片平皿试验, 发现其中2株对棉铃虫具有很高抗性, 校正死亡率达90%以上; 1株对棉铃虫具有高抗性, 校正死亡率达80%以上; 3株对棉铃虫抗性较明显, 校正死亡率44.7%～60.9%。     

农杆菌介导ODREB2B基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种黄麻子和中薯3号脱毒微型薯为外植体,利用根癌农杆菌介导法,将来源于诸葛菜的抗逆相关转录因子ODREB2B基因导入马铃薯,并对遗传转化的影响因素进行优化。获得抗性植株黄麻子33株、中薯3号27株,经PCR-Southern杂交分析,两品种分别有16株和14株呈阳性,证明ODREB2B基因已整合到马铃薯基因组中。