血管紧张素转换酶2(ACE2)基因在家猫不同组织中的表达差异分析

【目的】分析血管紧张素转换酶2 (ACE2)基因在家猫不同组织中的相对表达量及特定组织中的蛋白定位,为后续以ACE2基因为受体的疫病防控提供理论基础。【方法】采用qRT-PCR技术检测ACE2基因在家猫8个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和肠系膜淋巴结)中的mRNA相对表达水平,并利用免疫组织化学法检测家猫肾脏、胰腺和小肠中ACE2蛋白的组织定位。【结果】ACE2基因在家猫肾脏、胰腺和小肠组织的表达量极显著高于肺脏组织(P<0.01),在心脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织的表达量极显著低于肺脏组织(P<0.01);不同性别家猫的ACE2表达量存在一定差异,但不显著;ACE2蛋白在小肠组织中的表达量最高,其次是肾脏,在胰腺的表达量最低。【结论】家猫ACE2基因在各组织中广泛分布且存在一定的表达差异。     

山羊血管紧张素转换酶2基因的克隆表达与生物信息学分析

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比对发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2最高,为99%,与斑马鱼最低,仅为60%。遗传进化分析也表明该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1氨基酸(aa)~18氨基酸(aa)之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。成功构建山羊ACE2蛋白胞外部分(19~738 aa)表达载体,表达出的蛋白相对分子质量约为90×103,主要以包涵体的形式在BL21(DE3)中表达。[结论]本试验首次成功克隆了山羊ACE2基因编码区(基因序列号:KF921008.1),并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,同时在大肠杆菌中高效表达了其胞外区蛋白。     

斑马鱼血管紧张素转换酶(ACE)的生物信息学分析

采用生物信息学方法对模式生物斑马鱼中的血管紧张素转换酶进行了系列预测分析.结果表明,斑马鱼中有两个ACE基因,它们所编码的蛋白分别由1 324和785个氨基酸组成,其中1个是酸性蛋白,在水中不稳定,没有信号肽,属线粒体跨膜蛋白;另一个为酸性水溶性稳定蛋白,有信号肽.它们均含保守的Pfam Peptidase_M2结构域,属于M2家族蛋白.通过ESTs搜索发现这两个基因在斑马鱼不同组织和不同发育期的表达情况存在较大的差异.同源性比对和系统发育分析表明,斑马鱼ACE蛋白与低等脊椎动物(红原鸡、热带爪蟾等)、高等脊椎动物(人、鼠等)的同源性较高,达60%以上,说明ACE蛋白在系统演化上比较保守.     

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明：所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^-1,最佳线性范围为25～1 600 ng·mL     

昆嵛山血管紧张素转换酶抑制剂原料植物资源调查

血管紧张素转换酶抑制剂是近年来正迅速发展的一类心血管药物。对昆嵛山血管紧张素转换酶抑制剂原料植物资源进行调查,为该资源的开发利用提供基础资料。     

慢性心力衰竭患者血管紧张素转换酶I/D基因多态性及其与盐酸贝那普利疗效的关系

目的研究慢性心力衰竭（CHF）患者血管紧张素转换酶（ACE）基因I／D多态性及其与盐酸贝那普利疗效的关系。方法用多聚酶链式反应（PCR）对120例慢性心力衰竭患者进行ACE基因分型,并用盐酸贝那普利治疗8周,比较不同基因型患者的心功能、左室收缩末容积（ESV）、左室舒张末容积（EDV）及左室射血分数（LWF）的变化。结果CHF患者的Ⅱ、ID、DD型基因型频率分别为31．7％、33．3％、35．0％,I、D等位基因频率分别为55．8％、44．2％,患者的DD基因型频率及D等位基因频率明显高于对照组CP〈0．01）。服用盐酸贝那普利后,DD基因型患者的NYHA分级及EDV改善值大于Ⅱ、II）基因型患者（P〈0．01）。结论CHF患者ACE基因分型与盐酸贝那普利的疗效有关。     

昆仑雪菊中血管紧张素转化酶活性抑制成分的分离鉴定

[目的]从昆仑雪菊中分离纯化抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性成分,鉴定其化学结构,并评价其对ACE的抑制活性.[方法]以抑制ACE活性为指标,筛选出最佳的昆仑雪菊萃取溶剂,提取得到粗提物,活性跟踪分离纯化粗提物中的单体化合物,并对单体化合物的活性进行评价.[结果]最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到5个单体化合物,采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为咖啡酸甲酯;化合物2为脱镁叶绿素a;化合物3为β-香树脂;化合物4为异奥卡宁-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;化合物5为对香豆酸甲酯.活性测试结果表明:化合物1、4和5都表现出了较强的抑制ACE活性,其中化合物4对ACE的抑制活性最强,IC50为(167.02±4.32) μmol·L-1,其次为化合物1和5,IC50分别为(237.74±5.82) μmol·L-1和(331.57±4.69) μmol ·L-1,提示这些化合物可能为昆仑雪菊中潜在的降血压物质.[结论]本研究结果为深入研究昆仑雪菊的降血压作用机制提供了物质基础.     

罗格列酮对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ受体表达的影响

目的探讨罗格列酮对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ受体表达的影响及抗动脉粥样硬化可能的分子机制。方法体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞，应用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学技术，测定罗格列酮对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体和2型受体mRNA和蛋白表达的剂量、时间依赖的影响。结果基础状态下，血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体和2型受体均有少量的表达。血管紧张素Ⅱ显著上调血管紧张素Ⅱ1型受体（P〈0.01）和下调2型受体的表达（P〈0．05）。浓度依赖实验表明，不同浓度罗格列酮（20、30和50μmol／L）干预12h均显著下调血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA和蛋白的表达（P〈0．01），上调2型受体mRNA和蛋白的表达（P〈0．01和0．05）。时间依赖实验表明，30μmol／L的罗格列酮干预后，6h即出现明显的干预效应，24h时下调血管紧张素Ⅱ1型受体和上调2型受体mRNA和蛋白的作用最大，与血管紧张素Ⅱ组比差异有显著性（P〈0．01）。结论罗格列酮可呈浓度依赖和时间依赖性地下调血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA和蛋白的表达，上调血管紧张素Ⅱ2型受体mRNA和蛋白的表达，这可能是过氧化体增殖物激活型受体7激动剂罗格列酮发挥抗炎、抗动脉粥样硬化作用的重要机制。     

酶解工艺对海带酶解液抑制血管紧张素转化酶活性的影响

为明确海带对血管紧张素转化酶活性的抑制作用,通过单因素试验和响应面优化试验,探讨不同纤维素酶添加量和酶解时间对海带浆抑制血管紧张素转化酶活性的影响。结果表明:采用纤维素酶对海带浆进行酶解,建立了海带酶解液血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制率Y与纤维素酶添加量X₁、酶解时间X₂的数学模型:Y=-114.273 04+0.005 72X₁+1.491 99X₂-3.33333×10^-7X₁X₂-2.552 00×10^-7X₁²-0.004 47X₂²,得到优化酶解条件为:海带经切分匀浆后,在pH 6.0、添加纤维素酶11 060 U·g^-1、在室温条件下酶解169 min,所得酶解液对ACE活性的抑制率可达到41.43%左右。试验可知海带酶解液对血管紧张素转化酶(ACE)活性具有较高的抑制作用。     

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征大鼠肾素-血管紧张素系统的变化及其干预的实验研究

目的:观察油酸诱导的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)中肾素-血管紧张素系统(RAS)的变化,探索ALI/ARDS治疗新途径。方法:①建立ALI/ARDS动物模型,并利用症状、动脉血气分析、肺湿/干重比(W/D)和肺组织病理等指标评估;采用紫外分光光度法和放射免疫法分别测定RAS关键酶:血管紧张素转换酶(ACE)、ACE2和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),并研究其变化规律。②分别给模型鼠腹腔注射卡托普利、重组大鼠ACE2(rmACE2)和氯沙坦,观察干预效果。结果:①模型评判及RAS变化:模型复制成功,油酸组大鼠肺水含量较正常组明显增多(W/D:6.71±0.64 vs 4.02±0.10,P0.01),氧合指数明显下降(PaO_2/FiO_2:267±19 vs 450±15,P0.01),且病理显示明显的肺损伤改变;油酸组血浆中ACE2表达下降,而ACE表达明显升高,氯沙坦组ACE表达降低,对应ACE2表达升高;油酸组大鼠血浆AngⅡ水平明显增高,而氯沙坦组水平降低(76.50±29.21 vs 118.92±45.48,P0.05,单位:Pg/ml)。②RAS药物对ALI/ARDS的影响:与油酸组比较,卡托普利组W/D明显降低(5.35±0.25 vs 6.06±0.22,P0.05),而rmACE2组也出现下降趋势(6.33±0.32 vs 6.71±0.64,单位:U),但无明显统计学差异(P=0.542)。氯沙坦组降低最显著(5.35±0.25,P0.01,单位:U);氯沙坦可提高ALI/ARDS大鼠7d生存率。结论:①RAS存在激活,表现为关键酶发生显著变化:ACE、AngⅡ的升高和ACE2的降低。②干预RAS能部分改善ALI/ARDS肺损伤。其中以氨沙坦作用最为显著,且能最终提高7d生存率。③RAS可能开辟ALI/ARDS药物治疗的新时代,有望降低ALI/ARDS病死率。     

猪Annexin A2基因真核表达载体的构建及表达

根据猪的Annexin A2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增Annexin A2基因cDNA,并将其克隆到pGEM-T载体后进行测序分析,然后将测序结果正确的Annexin A2基因cDNA亚克隆到pEGFP-N1表达载体上,成功构建了表达载体.将表达载体瞬时转染Marc-145细胞,结果表明:表达载体pEGFP-N1 -ANXA2可以在Marc-145细胞中表达.     

ACE和ACE2在自发性高血压大鼠肾脏中的表达与作用分析

为观察血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素转化酶2(ACE2)在自发性高血压大鼠肾脏中的表达及它们与高血压形成的关系,取14周雄性Wistar-京都种大鼠(WKY)和自发性高血压大鼠(SHR)各8只,自由采食和饮水1周后测定大鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和心率(HR),称重后断头处死,取血液和肾脏组织进行如下试验:放免法测定血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量,肾脏组织中ACE、AT1、ACE2和Mas mRNA表达水平的Real-time PCR分析,肾脏组织中ACE2蛋白表达的比较分析。试验结果表明:SHR大鼠SBP和DBP均显著高于WKY大鼠,而心率和体重无显著差异(P>0.05);SHR大鼠血浆中AngⅡ含量和肾脏组织中ACE mRNA表达水平均显著高于WKY大鼠(P<0.05),肾脏组织中ACE2 mRNA和蛋白表达水平均显著低于WKY大鼠(P<0.05),2组大鼠肾脏组织中AT1和Mas mRNA表达没有显著差异(P>0.05)。SHR大鼠肾脏中ACE的mRNA表达显著升高,而ACE2的mRNA和蛋白表达均显著下降。高血压时,肾脏局部组织中ACE和ACE2表达失衡,表现为ACE-AngⅡ-...     

长毛兔和獭兔白细胞介素-2基因的克隆与真核表达

采用RT-PCR法从ConA诱导培养的德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到白细胞介素-2基因(IL-2),经序列测定表明,长毛兔和獭兔IL-2基因大小均为462 bp,两序列碱基组成无差异,该基因编码一个由153个氨基酸组成的多肽,包括20个氨基酸残基的信号肽和133个氨基酸残基的成熟肽。德系安哥拉长毛兔和白色獭兔IL-2基因间同源性为100%,与欧洲野兔及中国白兔的IL-2基因同源性分别为99.4%和98.9%。与GenBank中报道的猿、人、猕猴、狒狒、猫、马、大熊猫、犬、猪、水牛、山羊和鼠的IL-2核苷酸同源性分别为86.9%、86.7%、86.2%、86.1%、84.3%、84.3%、82.8%、82.6%、81.4%、76.9%、76.7%、75.0%。进化树分析发现,兔和猿的IL-2亲缘关系最近。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IL-2蛋白。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

玉米大斑病菌STK2的基因组定位、蛋白质结构预测及其表达

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌 GS115 中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;成功构建了STK2的真核表达载体pPIC9K-STK2,筛选获得了抗性转化子;在毕赤酵母菌中,经甲醇诱导得到了1个分子量约为41 kD的蛋白质组分且被分泌至胞外,该蛋白质的大小与理论分子量相符,推测Stk2蛋白已在宿主菌中表达并被分泌至胞外。【结论】玉米大斑病菌STK2位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,属于典型的MAPK蛋白激酶;该基因能在真核细胞中表达,获得了可溶性分泌蛋白质,为Stk2蛋白的多克隆抗体制备及基因的功能研究奠定基础。     

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

猪Ghrelin基因表达质粒构建及其促生长作用

通过RT-PCR获得猪Ghlelin基因cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )质粒中构建真核表达质粒pcDNA-pGhl,并将该质粒注射到大鼠和新西兰兔后腿肌肉中,以研究pGhlelin真核表达质粒对动物生长和血液相关激素分泌的影响。大鼠试验表明:pcDNA-pGhl在注射初期的1个月内有增加大鼠体重及在整个试验期有降低料重比的趋势。在注射质粒后第6天,试验组个体增重提高10.6%,差异显著;饲料转化率提高10%,差异极显著。新西兰兔试验表明:试验组血液GH水平一直高于对照组,且在注射后2周高出35%,同时随着GH浓度的增加,血液中SS的浓度相应升高。注射重组质粒pcDNA-sGhl有增加血浆GH和SS水平趋势。以上结果表明,Ghrelin基因真核表达质粒通过促进GH的分泌促进生长,但其促生长效能较短暂,可能是由于同时促进生长抑素分泌。     

猪CTSZ基因的克隆及真核表达载体的构建

组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础.     

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得新城疫病毒(NDV)Lasota株的血凝素神经氨酸酶(HN)基因片段,其长度约为1.7 kb,与已报道的NDV-HN基因片段大小一致.再将该HN基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,表明构建的重组质粒含有NDV-HN基因片段.