民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN-α1基因从基因组DNA克隆到pGEM-T载体,并进行测序分析。结果表明:犬IFN-α1基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点1、个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区;经二级、三级结构预测,该蛋白主要由5段α螺旋组成;犬IFN-α1基因与貉子、赤狐的同源性最高,为98%,在进化树中处于同一分支;在干扰素多肽链中,15L、18L、77W、96L9、9C1、24F、131L、137S、140AWE1421、45R和150R在所有分析物种中高度保守。     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。     

犬γ干扰素基因的克隆与序列分析

根据已发表的犬γ干扰素（Ｃａ－ＩＦＮ－ｒ）ｃＤＮＡ序列设计引物,用植物血凝素（ＰＨＡ）有机锗（Ｇｅ－１３２）刺激体外培养的犬脾细胞产生ＩＦＮ,提取ＩＦＮｍＲＮＡ,并以其为模板进行返转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出４８０ｂｐ基因片段。经酶切鉴定后将其克隆到ｐＵＣ１９的ＳｍａⅠ,构建重组质粒ｐＵＣ．ＩＦＮ。经酶切、ＰＣＲ及序列分析鉴定,可证明克隆的基因为犬γ干扰素,与所发表的核苷酸序列同源率为９     

不同品种猪IFN-α基因的克隆与序列分析

根据现有猪α干扰素(IFN-α)基因序列设计引物,应用PCR技术直接从肝组织基因组中扩增丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因。将克隆得到的特异性片段克隆入pGEM-TEasy载体中,转化感受态细胞JM109,运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株,并将筛选的阳性株进行测序。结果表明,得到了上述4个品系的猪IFN-α基因。核苷酸同源性均在97.2%以上,氨基酸同源性均在92.8%以上。     

犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN - αl基因从基因组DNA克隆到pGEM -T载体,并进行测序分析.结果表明:犬IFN - αl基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点、1个N糖基化位点和4个半胱氨酸...     

牛γ-干扰素基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布的牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因序列设计引物,应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以从牛外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,扩增出γ-干扰素成熟肽基因片断,并对其进行了克隆、测序及序列分析.结果表明,试验所设计引物可以成功用于扩增牛γ-干扰素成熟肽基因片段,所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达99.77%.     

猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析

参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。     

新兴猪干扰素-β基因的分子克隆与序列测定

根据NCBI GenBank 上登载的猪干扰素β基因序列(S41178),设计一对引物,直接从猪肝脏提取基因组DNA,经PCR 扩增及扩增产物的克隆、测序,获得了新兴本地猪干扰素β全基因片段,其大小为561 bp,与NCBI GenBank上登载的猪干扰素β基因序列完全一致,为进一步研究和开发猪基因工程干扰素制剂奠定了基础。     

猪γ干扰素的克隆与序列分析及腺病毒表达载体的构建

提取猪脾脏淋巴细胞中总RNA,应用RT-PCR技术扩增出γ-干扰素基因,将其克隆到pGEM-T载体上,并进行测序。结果表明,克隆获得的γ-干扰素基因全长为517个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸。与GenBank上已发表的猪γ-干扰素基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。将目的基因插入腺病毒穿梭质粒pAd-Shuttle-CMV载体中,构建出真核表达载体pAd-Shuttle-CMV-IFNγ-,在BJ5183细菌中同源重组,构建出腺病毒表达载体pAdenoγ-,为进一步研究γ-干扰素在腺病毒中的表达、检测其生物学活性奠定基础。     

鸡α-干扰素基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR方法,从ConA诱导的鸡淋巴细胞中扩增出鸡α-干扰素基因,经同源性比较,发现家禽α-干扰素核苷酸序列之间同源性较高,而与哺乳动物的同源性较低,说明家禽α-干扰素的生物学功能与哺乳动物可能存在一定差异。     

猪α-干扰素基因的分子克隆和序列分析

应用PCR技术从猪肝组织中扩增获得一条约500 bp的特异带,回收后连接到pMD18-T载体中,转化DH5α,酶切鉴定和并进行测序分析.结果表明,成功克隆获得猪-干扰素(INF-α)基因,501bp,编码166个氨基酸,与GenBank上序列号为M28623及X57191的序列相似性分别为96.6%和96.4%,氨基酸的相似性为91.6%.     

长白猪γ-干扰素基因的克隆与序列分析

将长白猪外周血淋巴细胞进行体外培养,在ConA的刺激下培养8h～24h后,提取培养的淋巴细胞的总RNA,应用RTPCR技术扩增淋巴细胞γ干扰素cDNA,并将其克隆到pGEMT载体上,进行测序。序列测定结果表明,克隆获得的IFNγ基因全长为534个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量为19.4ku。此基因与我国藏猪、成华猪以及GenBank上发表的猪IFNγ基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。说明几种我国地方猪IFNγ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变,同时也证实了长白猪干扰素γ基因的正确、完整克隆。     

猪白介素-18基因的克隆及其序列分析

通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT-PCR技术克隆了猪白介素-18(plL-18)基因。序列分析结果表明，克隆的plL-18基因序列与GenBank上登录的plL-18基因序列完全一致，与其他各物种的IL-18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL-18的进一步研究和开发奠定了基础。     

鸡IFN-γ作为治疗剂的应用前景

为了得到长期的保护性免疫，需要使用高效的佐剂，但大多数佐剂是油性的，会导致副的局部反应．从而使肉质量下降。另外．注射后严重的局部反应可能使抗原在注射部位被包裹，因而不会被免疫系统的细胞所识别。抗生素虽然普遍使用．但耐药菌的出现。又对人类造成新的威胁。同样，长期使用化学药物，增加了环境污染并导致肉制品中药物残留。这些因素驱