正调控元件拷贝数对黑曲霉PglaA启动子的影响

为获得转录水平更高的强启动子,提高黑曲霉中重组蛋白表达量,研究在黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因启动子PglaA基础上,构建分别含2、4、6个拷贝的正调控元件片段PglaA2R、PglaA4R、PglaA6R启动子。以黑曲霉木聚糖酶基因xynB为目的基因,研究正调控元件拷贝数对PglaA启动子的影响。构建黑曲霉表达载体pSZHG2R-xynB、pSZHG4R-xynB、pSZHG6R-xynB,采用农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。获得目的基因表达框整合在葡萄糖淀粉酶基因位点的纯合黑曲霉重组菌株PglaA2R-xynB、PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB。经SDSPAGE检测观察到重组菌株分泌约24.0 ku木聚糖酶蛋白条带。经酶活检测表明,木聚糖酶活力在第8天达最高,重组菌株PglaA4R-xynB(7 705.36 U·mL~(-1))、PglaA6R-xynB(8 466.32 U·mL~(-1))比PglaA2R-xynB(5 890.77 U·mL~(-1))分别提高1.31倍和1.44倍。荧光定量PCR结果表明,重组菌株PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB的xynB基因mRNA比PglaA2R-xynB分别提高2.2倍和5.3倍。可知,PglaA启动子正调控元件多拷贝显著提高木聚糖酶表达。     

白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达

研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18)。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1(GI:473517)设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶(GAA90749.1)相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。     

枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达

[目的]构建含不同信号肽编码序列的枯草芽孢杆菌分泌表达载体,并研究这些载体对脂肪酶A的分泌表达效率。[方法]克隆得到枯草芽孢杆菌168株的脂肪酶A编码基因,同时扩增得到蛋白质NprE、Bpr、YweA的信号肽编码序列,构建了脂肪酶A分泌表达载体pMA5-estA、pMA5-nprE-estA、pMA5-bpr-estA和pMA5-yweA-estA,并转化到枯草芽孢杆菌168株中得到相应的重组分泌表达菌株。[结果]对4株重组表达菌株进行摇瓶培养,所有菌株都实现了脂肪酶A的分泌,20 h后,168（pMA5-bpr-estA）的细胞外脂肪酶A的酶活力达到1.68 U/ml,约占该菌株脂肪酶A总表达量的86%。[结论]枯草芽孢杆菌Bpr信号肽对脂肪酶A具有较高的分泌效率。     

pyrG基因对西瓜噬酸菌致病性和组氨酸利用的影响

为研究pyr G基因与西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)致病相关性,利用同源重组的方法构建pyr G基因突变体(Δpyr G),对pyr G基因的功能进行分析。结果显示,pyr G基因影响病原菌的致病性、游动性、生物膜形成和定殖能力以及激发烟草过敏反应能力;pyr G基因影响his D基因的表达;此外,pyr G基因突变影响西瓜噬酸菌对组氨酸的利用。     

基于植物皂素提取液为发酵基质的酶表达及洗涤性能研究

以高浓度植物皂素提取液为发酵基质,利用枯草芽孢杆菌(CICC 23083)和地衣芽孢杆菌(CICC21085)发酵表达蛋白酶、果胶酶和脂肪酶。当基质中添加3%酵母膏时,CICC 23083单独发酵共表达蛋白酶和果胶酶,这两种酶在32 h获得最大酶活力(分别为792.6和4 352.9 U/mL);而当基质中添加9%蔗糖时,两种酶分别在32 h和16 h获得最大酶活力(258.5和2 497.5 U/mL)。在双菌株混合发酵表达3种酶的研究中,当基质中添加3%酵母膏,脂肪酶、蛋白酶和果胶酶的最高酶活力分别达166.7、245.8和4 281.6 U/mL。当基质中添加7%蔗糖,最高脂肪酶活力降至133.3 U/mL,而蛋白酶和果胶酶最大酶活力分别提高至327.4和3 318.2 U/mL。双菌株混合发酵液的相对去污力比单菌株发酵液分别提高11.1、15.2个百分点,比未发酵植物皂素提取液提高22.6个百分点。发酵前后的皂素液泡沫高度没有明显变化,维持在(157±5)mm。     

凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表达研究

研究将凤尾菇漆酶基因Lac4(Gene Bank登录号AJ507327.1)cDNA克隆到表达载体pSZHG10-6-2上,通过农杆菌介导法导入黑曲霉CICC2462中,筛选得到糖化酶基因glaA位点发生同源重组的黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取上清液作SDS-PAGE检测、酶活测定及酶学性质和酶稳定性分析,研究重组漆酶对染料脱色影响。结果表明,成功分泌表达重组漆酶r Lac4,其活性在第9天时达酶活最高峰1 211 U·L~(-1);酶学性质研究发现,其最适反应温度为60℃、pH为4.5,且在10~30℃及pH 5.0~6.0稳定性较好。最适反应条件下,重组漆酶对ABTS的Km为0.142 mmol·L~(-1),最大反应速率Vm为0.693 mmol·L~(-1)·min~(-1)·mg~(-1);通过重组漆酶研究4大类染料脱色能力,发现ABTS为介体时该漆酶对三苯基甲烷类孔雀绿脱色可达44%,杂环类中性红、偶氮类甲基橙脱色率分别13%和11%,而对蒽醌类活性亮蓝(RBBR)降解作用不明显,重组漆酶对孔雀绿的脱色效率具有较大应用价值潜力,对含三苯基甲烷染料废水处理应用前景良好。     

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示CALB及工业化培养基发酵条件优化

[目的]探索南极假丝酵母脂肪酶B更加经济、简便的固定化方法。[方法]根据南极假丝酵母脂肪酶B的成熟多肽序列,人工合成calb基因。将其克隆到质粒pYD1中的AGA2基因下游,获得的重组质粒pYD1-CALB,转化S.cerevisiaeEBY100菌株,并利用酿酒酵母工业化培养基发酵。[结果]成功构建表面展示CALB的酵母工程菌株;重组菌株连续传代10次表达酶活力基本保持不变,具有良好的遗传学稳定性;经工业化培养基发酵优化后,25℃发酵48 h,CALB水解活力可达4.25 U/ml,冻干粉活力可达147.82 U/g干细胞。[结论]利用酿酒酵母表面展示系统固定化南极假丝酵母脂肪酶B具有可行性,且工业化培养基的使用降低了发酵成本。     

脂肪酶产生菌的筛选·产酶条件及酶特性研究

[目的]筛选脂肪酶高活性菌株作为脂肪酶生产菌株和脂肪酶基因的供体菌。[方法]从油脂厂等地采集26份含菌样品,采用溴甲酚紫平板对样品进行初筛,以产脂肪酶发酵培养基摇瓶复筛,获得1株产脂肪酶活性较高的菌株09-7-1,经鉴定该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。采用正交试验对影响该菌株产酶的因素进行了研究,并探讨了该菌株所产脂肪酶的性质。[结果]该菌株最佳产酶条件：碳源为0.5%的可溶性淀粉,氮源为0.2%的酵母膏,培养温度为32℃,发酵液pH为5.2,该菌株最初发酵液中酶活力为13.164 U/ml,优化后酶活力达24.112 U/ml,是最初酶活力的1.83倍。该菌株所产脂肪酶最适作用温度为30℃,最适作用pH为7.0;酶液在60℃保温90 min后,活性损失较少,pH为5.5～10.0内稳定。[结论]该研究可为脂肪酶生产和基因研究奠定基础。     

耐有机溶剂脂肪酶基因lipI的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

为了实现耐有机溶剂脂肪酶基因的真核表达,参照GenBank公布的脂肪酶基因序列设计简并引物,通过PCR扩增出G.geotrichum SXL-107的全长1 692 bp、编码563个氨基酸的脂肪酶基因lipI,基因登录号为JX074060.利用Signal P 3.0软件对lipI基因序列进行分析,将去除自身信号肽的成熟lipI基因克隆到诱导型表达载体pPIC9K上,构建胞外重组表达载体pPIC9K-lipI,转化毕赤酵母KM71,发酵培养72 h,发酵上清液中脂肪酶活力达到70 U/mL,与野生型脂肪酶产生菌Galactomyces geotrichum SXL-107相比,脂肪酶活力提高7倍.获得的重组脂肪酶的最适温度40℃、pH值为6.5,在10％的甲醇溶液中作用48 h后仍然保持60％以上的酶活力.     

亚麻脱胶用复合酶高产菌株的诱变选育

以黑曲霉(Aspergillus niger)HYA4为出发菌株,采用紫外线(UV)进行诱变处理.在最佳紫外线照射剂量120 s的处理条件下,筛选获得了一株亚麻脱胶酶高产突变株黑曲霉A15.经过连续传接5代,该菌株产酶稳定性良好.固体发酵后聚半乳糖醛酸酶活力达到2 854.27 U/g,木聚糖酶活力可达97.01 U/g,分别比出发菌株黑曲霉HYA4提高了59%和26%.     

土壤中脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化

从上海地区富含油性的土壤中,以橄榄油为唯一碳源进行富集培养、以罗丹明B为指示剂的平板进行初筛,摇瓶复筛得到产脂肪酶菌株51-43。通过对51-43进行形态学观察,以及18S rDNA特征片段比较分析,初步确定51-43为黑曲霉(Aspergillus niger)。通过单因素实验和正交实验,对黑曲霉51-43产脂肪酶的发酵条件进行优化。确定其最优发酵条件为:蛋白胨2.35%,小麦粉1%,K2HPO40.1%,MgSO4.7H2O 0.05%,CaCl20.01%,NH4Cl 1%,Tween-80 0.5%,橄榄油1%,pH 7.0。此培养基在28℃,160 r/min的条件下发酵培养72 h,脂肪酶水解活力达到19.28 U/mL,是初始发酵培养基条件下所得脂肪酶酶活的2.21倍。     

黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶发酵条件优化

[目的]优化黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验和正交试验相结合的方法优化了黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[结果]单因素试验结果表明,以蔗糖为碳源的黑曲霉生长最好,所产酶的活力最高,最佳碳源浓度为15g/L;蛋白胨浓度为15g/L时黑曲霉干重最大,蛋白胨浓度为10g／L时所产酶的活力最高;pH值为5时黑曲霉的生物量最大,pH值为4时所产酶的活力最高;培养温度为30℃时,所产酶的活力最高。最佳培养基组成为葡萄糖20g／L＋蛋白胨5g/L＋MgSO4 0．05g/L＋KC10．5g/L＋K,HPO4 1g/L＋FeSO4 0．5g/L。当pH值为5,发酵温度为25℃,孢子接种量为10^6cfu/ml,发酵时间为96h时,培养基上黑曲霉产α-半乳糖苷酶的活力最高,达到（3．250±0．035）U／ml。[结论]该试验为仪一半乳糖苷酶的工业化生产提供了参考依据。     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的诱变选育及固体发酵条件的研究

以黑曲霉(Aspergillusniger)为出发菌株,经紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)、60Co诱变,筛选出β-葡萄糖苷酶的活力比原菌株明显提高。并通过单因素和正交实验研究了该酶的固体发酵条件,采用优化配方,使酶活力达到169.2U/ml。     

黄绿木霉菌等菌株混合发酵生产纤维素酶的研究

以黄绿木霉菌株、黑曲霉及绿色木霉菌株为实验材料,研究三种不同菌株之间相互混合产纤维素酶能力的变化。在150mL三角瓶的装液量为40mL、165—170r／min、28℃条件下,不同混合菌株发酵培养的产酶情况有较大差异,黄绿木霉菌与曲霉菌混合培养4d产CMC—Na酶的能力最强,三种菌株混合后发酵6d产滤纸纤维素酶能力最强,而黄绿木霉菌单独发酵6d产β-葡萄糖苷酶能最强。     

黑曲霉D226乳糖酶分离纯化研究

为从黑曲霉D2-26发酵液中得到单一的乳糖酶组分,以便研究其酶学性质。试验通过采用过滤、超滤、硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素-32离子强度梯度层析、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素-32 pH梯度层析等方法从发酵液中分离纯化乳糖酶,纯化酶液经PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带。为此建立了一套简单易行的黑曲霉D2-26乳糖酶分离纯化方法。     

黑曲霉产木聚糖酶的固态发酵条件优化

[目的]研究培养基组成和培养条件对黑曲霉固态发酵产木聚糖酶的影响。[方法]以木聚糖酶酶活为评价指标,利用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基组成、pH值、培养时间、培养温度和接种量对黑曲霉产生木聚糖酶的影响。[结果]最佳培养基组成为：麸皮与玉米芯质量比5∶3,（NH4）2SO4、KH2PO4、CaCl2和MgSO4相对于固体料的质量百分数分别为1.0%、0.2%、0.1%和0.1%）,料液比1∶1.7;最优培养条件为：pH值7.5、培养温度28℃、培养时间60h,其间翻曲2～3次;在此工艺条件下,木聚糖酶的活力可达14698.21IU/g。[结论]该优化条件为木聚糖酶的工业化生产和应用提供了依据。