哺乳动物转基因载体——piggyBac转座子

piggyBac转座子具有识别位点特异性5'-TTAA-3',剪切和插入都不留下印迹,且高效转座。基于piggyBac转座子的特性,借助载体系统,已应用于哺乳动物转基因的研究。此外,piggyBac转座子还应用于基因诱导突变和基因治疗等领域。RNAi技术作为基因功能研究的一个工具,在应用于克服畜牧业中家畜的生产繁殖障碍等方面已取得一定研究成果。本文对piggyBac转座子的结构和特性、转座机制及影响因素和在动物中应用等方面进行总结,为RNAi技术借助piggyBac转座子用于哺乳动物转基因提供理论依据。     

piggyBac转座子应用研究进展

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggyBac转座子功能和分布的深入认识,piggyBac转座子将更多应用于基因功能研究,基因治疗,转座子介导的细胞系基因诱变及基因工程蛋白表达等基础研究和应用研究中。     

piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展

piggyBac（PB）转座子已被证明是一种高效的非病毒基因工程操作工具,现广泛用于基因操作和转基因动物研究中。借助PB转座子已获得转基因小鼠、鸡、猪、山羊等动物。文中重点就PB转座子在畜牧兽医科学研究中的应用进行综述。     

A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

转座子在动物转基因研究中的应用

转座子是生物界中存在的一类可移动的遗传因子,它们在转基因和基因组进化中扮演了一个极其重要的角色.转座子技术已成为制备转基因动物的重要手段.论文综述了转座子及其在动物转基因领域的相关应用,并对转座子技术进行了展望.     

昆虫转座子及在家蚕中的应用

概述了近年来广泛应用于昆虫的若干转座子及其基本构造和应用;着重讨论了piggyBac转座子的构造和转座机制及所作成的转基因昆虫种类及标记基因:同时列举了在家蚕转基因中的实例.     

转座子在转基因动物中的应用

转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一,作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆,一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。     

外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的整合位点分析

以piggyBac转座子为介导的显微注射家蚕早期胚胎的技术,是目前获得转基因蚕的有效和主要方法。基于piggyBac以随机方式发生高频切出和转座的特点,已将其开发成各种遗传分析工具,用于果蝇、小鼠和家蚕等模式生物的基因功能研究。本文旨在分析外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的基因组整合位点特征,以期为更好的利用其开展家蚕转基因研究提供参考。采用反向PCR和生物信息学等方法,获得并分析了转基因家蚕中67个外源piggyBac的整合位点,结果显示:有28个整合位点位于基因间区,22个位于基因内部,但不在外显子区域;在整合位点两侧各10Kb区域范围内,注释基因多为转座酶或反转录酶等,推测其可能为piggyBac插入整合的热点区域(hotspotregions);此外,有47个整合位点可定位至家蚕的18条染色体上。     

基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究

将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

适用于实用家蚕品种转基因的蚕卵滞育解除方法

实用家蚕品种转基因是利用分子靶标实现家蚕品种改良与创新的最直接和有效手段,建立高效的适合于转基因显微注射的蚕卵滞育解除方法则是目前家蚕转基因在技术层面尚待解决的关键问题之一。采用早期浸酸、低温催青、复式催青3种方法解除显微注射转基因蚕卵的滞育。结果表明,3种人工处理方法均能解除蚕卵滞育,且获得的非滞育性蚕卵可通过显微注射得到转基因阳性个体,其中采用复式催青法处理的子代蚕卵滞育解除率最高,转基因阳性蛾圈率约25.00%,明显优于低温催青和早期浸酸处理。此外,采用早期浸酸处理,日系品种的蚕卵滞育解除率高于中系品种;采用低温催青和复式催青处理,中系品种子代蚕卵滞育解除率则显著高于日系品种。     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

家蚕转基因研究及肌动蛋白A3启动子的表达分析

通过显微注射法,将转基因载体pBcA3EG及辅助质粒pA3H导入产后1h的蚕卵,在G1代获得家蚕转基因的阳性个体.通过对G2代转基因蚕基因组的Southern杂交分析表明,获得的该转基因品系为EGFP基因的单拷贝插入.同时对G2代个体不同发育时期及不同组织进行荧光观察,发现EGFP在转基因家蚕幼虫期的表达较其它时期强,而幼虫时期强烈的EGFP主要由中肠组织的杯形细胞高量表达所致.这些结果初步表明A3启动子在家蚕的不同发育时期及不同组织存在表达的活性差异.     

家蚕转基因载体pBacA3EG在家蚕培养细胞中的表达

本研究利用质脂体介导法将构建好的家蚕转基因载体piggyBacA3EG转染家蚕培养胚胎细胞SWAU1-BmE,转染后48h在荧光显微镜下观察到大量的发绿色荧光的细胞, 200h后,仍有部分细胞发绿色荧光.通过细胞爬片观察发现,绿色荧光是由细胞的胞质部分发出的,细胞核不发光.经RT-PCR检测,能在转染细胞cDNA中扩增出EGFP片段,表明该表达载体构建正确,且能在细胞水平进行瞬时表达,可以用于家蚕转基因的下一步研究.