杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白（CSL）作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。图5参10     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

杉木ATP合酶基因的克隆及其在逆境下的表达分析

【目的】为解析杉木ATP合酶复合亚基基因（ClF0F1-ATP）在抵抗逆境胁迫中的功能,研究克隆了杉木ClF0F1-ATP基因,并分析其在不同逆境中的表达特征,以期为阐明杉木ClF0F1-ATP基因在杉木生长发育和响应干旱、温度以及盐胁迫逆境过程中的分子机制提供科学的理论依据。【方法】以第三代杉木种子为试验材料,运用RT-PCR技术克隆获得了一个杉木ATP合酶基因,命名为ClF0F1-ATP,并采用了生物信息学技术与亚细胞定位研究对该基因的功能进行了分析和预测,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了该基因在低强度干旱、高强度干旱、低盐、高盐、低温以及高温胁迫下的表达模式。【结果】对ClF0F1-ATP基因的编码的氨基酸序列进行的预测分析结果显示,杉木ClF0F1-ATP基因全长618 bp,共编码205个氨基酸,杉木ClF0F1-ATP蛋白的化学分子式为C₉₈₃H₁₅₆₁N₂₅₉O₂₉₁S₆,蛋白相对分子量为21 856.13 Da,理论等电点为6.20。蛋白质理化性质...     

桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

AP1（APETALA1）基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即OfAP1基因,其中开放阅读框长为720 bp（注册号为MH593222）。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%~88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的OfAP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中,OfAP1在成花转变及花芽分化初期（花瓣、花萼分化期）表达量较高,随后呈下降趋势。这说明OfAP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。     

洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析

采用PCR法克隆了洋葱的花青素合成酶基因AcANS,并对其进行序列比对和生物信息学分析。结果表明,其开放阅读框为1059bp,编码352个氨基酸残基;具有一个富含AT的内含子,符合GT—AG规则;其蛋白质第210～309肽段含有20G—Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域。     

杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆与生物信息学分析

为了解杉木天冬酰胺合成酶基因(ASN)的相关信息,以杉木组培苗105为材料,克隆获得杉木ASN3基因,该基因为一个完整的开放阅读框,共编码231个氨基酸,生物信息学分析显示:ASN3基因编码蛋白为不含卷曲螺旋结构和信号肽的非跨膜稳定亲水蛋白,定位于微体(过氧化物酶体),具有多样的磷酸化位点,其中丝氨酸15个,苏氨酸7个,酪氨酸3个,其二级及三级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。     

高粱SbCAD4基因的克隆与序列分析及原核表达分析

以高粱品系早亨加利为材料,通过RT–PCR扩增,克隆高粱SbCAD4基因。测序结果表明,克隆的SbCAD4基因与NCBI基因库中高粱IS11861品系只在编码序列第548位有1个碱基的差异,而二者的氨基酸序列完全一致。进化树分析结果表明,SbCAD4与拟南介、水稻、玉米的木质素合成CAD基因位于同/L1个群中。比对分析结果表明,SbCAD4与木质素合成基因具有相同的结构域。将构建正确的重组质粒(pMAL–SbCAD4)转化入大肠杆菌菌种BL21中进行诱导表达的结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L。经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,SbCAD4融合蛋白在SDS–PAGE电泳分析时呈现１条蛋白带。利用纯化的蛋白对SbCAD4进行酶活测定,其酶动力学参数Km值为5.2 μmol/L,Vmax为5.8 μmol/(min?mg),表明SbCAD4具有肉桂醇脱氢酶活性。     

杉木ClLAR基因的克隆及遗传转化拟南芥

为探究杉木种子发育过程中无色花青素还原酶(LAR)基因在类黄酮生物合成途径中对原花青素(PA)合成的分子调控机制,以杉木种子为试验材料,通过RT-PCR结合RACE的方法成功克隆到杉木ClLAR基因全长,该基因的cDNA全长为1625bp,具有1个1242bp的开放阅读框(ORF),编码413个氨基酸。构建pCambia3301-ClLAR植物表达载体,运用冻融法将重组质粒转至农杆菌GV3101,通过花序侵染法获得拟南芥转基因植株,利用Basta溶液和PCR验证筛选出阳性苗,确定目的基因ClLAR已整合至拟南芥基因组中。研究结果为深入分析杉木ClLAR基因调控PA合成的分子机制和ClLAR蛋白功能奠定了基础。     

雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析

根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因.氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94% ,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A 结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因.对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异.     

文冠果LEC1基因的克隆及表达分析

目的文冠果隶属无患子科, 是我国北方重要的油料树种, 种子含油量高, 是制备食用油、生物柴油等的优质原料。本研究旨在克隆文冠果Leafy Cotyledon 1(XsLEC1)基因, 进行序列及表达模式的分析。方法以文冠果种胚为试材, 利用RT-PCR和RACE技术克隆文冠果LEC1基因。采用Protparam及TMHMM2.0软件预测XsLEC1蛋白的理化性质和跨膜结构域, ProtComp9.0及Motif Scan软件预测XsLEC1蛋白的亚细胞定位及蛋白功能, BioEdit及MEGA7软件分析XsLEC1蛋白的多重序列比对和进化关系。运用RT-PCR和实时荧光定量PCR分析XsLEC1基因的表达模式。结果XsLEC1 cDNA全长1 035 bp, 包含一个长度为690 bp的开放阅读框(GenBank号为MF616360), 可编码229个氨基酸。推导的氨基酸序列包含一个HAP3亚基的保守功能域B。该保守功能域内含有组蛋白折叠中的3个α螺旋(α1、α2、α3)和两个短环结构(L1、L2)。在线预测该蛋白为稳定的, 亲水性蛋白, 无信号肽和跨膜区域, 定位于细胞核, 存在多个磷酸化位点。二级结构主要由α螺旋和无规则卷组成。进化分析表明, 该蛋白序列与同科龙眼亲缘关系最近, 其次为麻风树和毛果杨。RT-PCR实验得出, XsLEC1基因在文冠果的根、茎、叶及花中均无表达, 在种子中出现较高表达。实时荧光定量PCR结果进一步显示, XsLEC1基因在种胚中有明显的时序表达特性, 在种胚发育的前期(花后33、40、47 d)表达较高, 在种胚发育的后期(花后54、61、68 d)表达较低, 至花后75 d时仅有微量表达, 而在完全成熟的种胚(花后81 d)中未检测到XsLEC1的表达。结论文冠果LEC1基因的克隆及表达分析, 为以后深入研究XsLEC1的功能奠定了分子基础, 同时对生产实践中文冠果油脂品质的改良有一定的实践意义。      

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

碧冬茄花特异表达基因启动子PchsA的克隆与序列分析

根据Ingrid M．报道的碧冬茄花特异表达基因CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物，以碧冬茄总DNA为模板，通过PCR扩增出约370bp大小的DNA片段，回收后克隆到pUCm—T质粒载体上，经转化、筛选确定重组子，酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序，得到片段长度为370bp．采用DSgene分析软件进行序列分析发现其基本具有启动子的所有保守序列，TATAbox，CCAATbox，Anther box，G—box，TACPyAT box，box1，box2，Capsite等，且经InternetBLAST程序和DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析，显示序列与已报道序列同源性为96％，登陆GenBank，ID号为AY360358。     

杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达

为探究杉木涩籽形成过程中,花青素还原酶(ANR)基因在类黄酮生物合成途径中的分子调控机制,以种子为试验材料,通过RT-PCR结合RACE的方法对杉木ANR基因进行全长克隆,运用q PCR技术分析不同涩籽率的杉木家系中ANR基因在种子不同发育时期的表达模式。结果显示,克隆到的ANR基因全长c DNA序列为1 357 bp,具有一个1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸。保守域预测显示ANR蛋白属于SDR超家族,具有一个FR_SDR_e特异性结构域。q PCR结果发现,在高涩籽率杉木中,90、100 d的表达量一直显著高于中、低涩籽率杉木;而在中、低涩籽率杉木中,ANR基因的表达模式仅仅是种子发育80 d时较高,之后明显下调。表明杉木涩籽率可能与其ANR基因表达相关。     

桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化时期的表达分析

  目的  桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物,其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。  方法  以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhonggui’为材料,采用石蜡切片观察其花芽分化进程,运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA（FLOWERING LOCUS CA）基因分别进行克隆及表达特异性分析。  结果  克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp,其开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高,同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期,无论叶还是花芽中,19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。  结论  桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化,参与桂花的花芽分化,使桂花的花期提前。     

核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

谷胱甘肽转移酶GST基因在植物逆境响应中具有重要作用。核桃Juglans regia是重要的经济林木,其生长和产量受环境因子的影响。为探索核桃抗逆生理机制,筛选抗逆基因,以品种‘香玲’‘Xiangling’为试材,克隆获得核桃JrGSTU23基因,并进行生物信息学和基因表达分析,预测JrGSTU23的基本生物功能。结果显示:JrGSTU23基因的开放阅读框（ORF）为684 bp,编码多肽为25.89 kDa,包含氨基酸227,理论等电点为5.20。与碧桃Prunus persica,毛果杨Populus trichocarpa等同源蛋白进行多序列比对,发现均有GST-Tau保守结构域,且与香蕉Musa acuminata和毛果杨等的Tau家族GST蛋白具有较近的进化关系;其上游2 000 bp启动子中含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）发现,JrGSTU23在植物激素脱落酸（ABA）,茉莉酸（MeJA）,水杨酸（SA）和非生物胁迫氯化钠,聚乙二醇（PEG 6000）,6℃等胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在根和叶中的表达趋势不同。表明JrGSTU23受不同植物激素和非生物胁迫诱导,且具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中起到一定作用。     

植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成

目的系统鉴定和分析小麦纤维素合成酶(CesA)基因家族成员,为进一步阐明小麦CesA基因家族的生物学功能奠定理论基础。方法利用生物信息学方法在小麦全基因组上系统鉴定小麦CesA (TaCesA)基因家族的成员。对小麦CesA基因的系统发育、染色体位置和转录组进行分析。预测TaCesAs基因结构、保守基序、顺式元件、蛋白质特征和亚细胞定位,并对小麦及其亚基因组供体中CesAs同源基因进行比对。结果共鉴定出21个TaCesA基因,分为3组(a、b和c)。基因结构分析发现TaCesA含有多个内含子,但部分基因非翻译区(UTR)结构存在缺失。TaCesA基因与其亚基因组供体关系保守。TaCesAs的上游包含45个与生物胁迫/非生物胁迫、生长发育和植物激素相关的元件,预示这些基因可能参与响应小麦的生物学功能。表达谱结果显示：TaCesA基因在缺磷、高温、低温、干旱、条锈病、白粉病和赤霉病等逆境胁迫中均有响应。结论小麦CesA基因具有保守的基因结构和蛋白结构,且在小麦抵御非生物和生物胁迫中起着重要作用。