猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)荧光PCR检测方法的建立

猪链球菌病是严重危害人兽健康的一种传染病。常规的猪链球菌血清学检测方法不但费时，而且只能鉴定到血清型。荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，灵敏度比常规PCR高出100倍以上，而且整个过程只需要0．5～2h，还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性，是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法。本研究选择MRP设计引物进行PCR，反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因，从而确定待检菌是否为猪链球菌2型致病株。本方法的建立，为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、严防疫情传入传出奠定了基础。     

猪链球菌2型人源株MRP的表达及其单克隆抗体的制备与应用

将猪链球菌2型(SS2)人源株Habb mrp基因进行截短修饰后,克隆于pGEX4T-2载体中,转化大肠杆菌诱导表达约61 000的融合蛋白MRP-GST,该蛋白经凝血酶作用去除重组蛋白中的GST标签,得到约35 000纯化的MRP.Western blotting证实MRP可被SS2阳性血清特异性识别.以纯化的MRP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA进行筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP特异性单抗的细胞株.特异性试验表明该6株单抗与SS2的另外2种蛋白、大肠杆菌均不发生交叉反应.以2138单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立夹心ELISA对71株标准菌株和122株猪链球菌野毒株进行MRP的表征鉴定,标准株检测结果与背景符合率为为97.2%(69/71),其中34株标准血清型菌株检测的符合率为100%.表明该方法可用于猪链球菌的快速诊断和流行病学调查.     

检测猪链球菌２型的溶菌酶释放蛋白（ＭＲＰ）的ＰＣＲ方法的建立

根据猪链球菌２型的mrp基因自设计和合成了一对可扩增长度为８８５bp目的片段的引物，成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白（ＭＰＲ）的ＰＣＲ方法，用ＸbaⅠ内切酶进行酶切，获得了与预期一致的５７8bp和３０７bp２的２个片段，并进行了ＰＣＲ的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的ＰＣＲ检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１００个细菌。另外，对９株从病猪体内分离的猪链球菌２型菌株进行检测了８个呈阳性；对１５份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是１份为阳性。结果表明此法特异性敏感性均很高，可作为ＭＲＰ快速诊和流行病学调查的手段。     

猪链球菌2型MRP与FBPS部分片段串联基因的原核表达

根据猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)的基因序列,选取可能含有抗原决定簇的两片段,各设计合成一对引物,使之含有共同的酶切位点。通过T4DNA连接酶串联两片段,构建原核表达载体pET32a-mrp-fbps,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度,不同浓度IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,表达约为80kD的融合蛋白。Westernblot结果表明重组蛋白可被SS2阳性血清所识别。证实串联表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,是重要的保护性抗原,本试验为进一步研究猪链球菌亚单位疫苗奠定了基础。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因（mrp）的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a（＋）中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带（27.0 ku）。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

猪链球菌2型毒力因子多重荧光PCR检测方法的建立与应用

本研究通过在扁桃体组织中添加猪链球菌2型菌后提取的DNA为模板，建立了检测猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR检测方法，并对部分猪扁桃体和肌肉组织进行了检测。结果发现，本方法可以快速检测出组织内的致病性猪链球菌2型，且特异性强，灵敏度达到100CFU。采用本研究建立的方法对北京和江西部分屠宰场猪扁桃体及北京市售猪肉进行检测，没有发现致病性猪链球菌2型感染。本检测方法的建立，有利于快速确定人-猪链球菌感染原的致病性，这为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、保护消费者的健康和生命安全奠定了基础。     

2型猪链球菌毒力因子概述

2型猪链球菌感染已成为影响全世界养猪业的重要问题之一。它主要引起猪脑膜炎、肺炎、心内膜炎、关节炎、败血症等,并可感染人。猪链球菌2型致病机理还不太清楚,至今为止,已知的毒力因子有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、溶血素、粘附素等。文章对猪链球菌2型毒力因子做一系统概述。     

SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性

运用ANTHEPROT 5.0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测MRP的B细胞优势袁位簇;PCR扩增出表达预测的抗原肽段的基因(mrp-1),构建重组原核表达载体pET32a-mrp-1,IPTG诱导表达,以渗透性休克法纯化重组蛋白;使用重组蛋白免疫血清和灭活猪链球菌2型SS2免疫血清Western blotting检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性;纯化的重组蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠,SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力.Western blotting显示预测的950～1 210 aa肽段与PET32a重组表达的蛋白(MRP)具有良好的免疫原性和反应性;攻毒试验结果表明重组蛋白对小鼠的免疫保护率为菌体免疫所提供保护率的66.7％.研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础.     

猪链球菌2型毒力因子研究进展

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌,其主要毒力因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、谷氨酸脱氢酶等,但是这些经典的毒力因子不足以解释猪链球菌病发病的临床症状,而且毒力表型往往与实际毒力及临床症状不符。近年来随着研究的深入,鉴定出一系列毒力相关元件,主要有Sao蛋白、存在于89K毒力岛的双信号转导系统(salk-salR)、dltA基因、pgdA基因、srtA基因、Ⅳ型二肽基肽酶(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPPⅣ)、毒力调控子R(control of virulence R,CovR)、烯醇酶(enolase)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GlnA)等。论文对以上毒力因子研究进展进行综述,以期为SS2毒力因子及致病机制研究提供参考。     

猪链球菌2型表面蛋白sp融合基因的构建与高效表达

利用PCR方法从猪链球菌2型四川资阳分离株449-1扩增出sp基因,克隆到pMD18-T载体中,构建出克隆载体pMD18T-sp。以SalⅠ和BamHⅠ从pMD18T-sp中切下目的sp基因片段并克隆到质粒pMAL-p2X中,构建重组表达质粒pMALp2X-sp,转化宿主菌TB1中进行诱导表达。分析表明sp基因序列比GenBank报道序列AY864331少了270 bp;SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了136 Ku左右的目的蛋白MBP-Sao,目的蛋白为可溶表达,约占菌体蛋白总量的12.3%。表达的蛋白可用Amylose树脂纯化。将纯化的融合蛋白MBP-Sao免疫家兔,所得抗血清经ELISA检测,结果显示融合蛋白MBP-Sao包板抗体效价达1:16 000,且与猪链球菌2型和9型呈阳性反应,而与沙门氏杆菌及巴氏杆菌呈阴性反应。本试验对猪链球菌2型表面蛋白Sao的高效表达及其免疫原性进行了初步研究,为进一步研究猪链球菌2型表面蛋白Sao的结构和功能奠定了基础。     

多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用

建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

表达猪链球菌溶血素基因的减毒沙门氏菌的构建及鉴定

将猪链球菌溶血素（suilysin，SLY）基因克隆入原核表达栽体pBV220，将重组质粒再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089株，经PCR和酶切鉴定，构建成携带猪链球菌溶血素基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。结果表明：该减毒株具有相对安全性；用酶切和PCR鉴定法证实在无抗生素存在的条件下携带重组质粒的减毒株比较稳定；SDS-PAGE显示SLY能在宿主菌中进行表达。该结果为进一步研究制备猪链球菌口服活疫苗奠定了基础。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

猪链球菌2型胞外蛋白因子基因片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2)胞外蛋白因子（extracellular factor protein,EF)基因序列，设计和合成1对引物，以猪链球菌2型江苏98分离株HA9801的基因组DNA为模块，通过PCR技术，扩增epf基因1207－1675bp序列，并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游；将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，经IPTG诱导可表达相对分子质量约为41000的融合蛋白。用EF抗血清进行的免疫印迹分析表明，含有epf基因1207－1675bp序列编码的肽段的融合蛋白不能被EF抗血清识别。     

Streptococcus suis isolated from pigs in Finland

A total of 58 Streptococcus suis strains were isolated from deceased pigs submitted to the National Veterinary Institute, Regional Laboratory in Kuopio, Finland, over a 3 1/2 year period, most frequently from cases of pneumonia. The bacteria were isolated from cases of meningitis, sepsis, rhinitis, endocarditis and abortion. S. suis was also isolated from nasal cavity, lung and brain of some sick piglets without signs of inflammation. Further S. suis was detected in 12 out of 107 tonsils of healthy fatteners tested. S. suis strains were identified by biochemical methods followed by typing. The most common capsular types were 7, 3 and 2, respectively. Only one type 1 strain and no types 6 and 9 strains were found. All S. suis strains tested were sensitive to penicillin and ampicillin.S. suis is not uncommon in Finnish pig herds. S. suis may be regarded as a potentially pathogenic organism which under certain predisposing conditions may cause serious disease.     

猪链球菌2型溶血素B细胞表位预测

目的预测猪链球菌2型(SS2)溶血素(SLY)B细胞表位。方法以DNAstar分析为主,综合分析二级结构、亲水性、表面可及性及抗原性指数,辅以吴玉章氨基酸抗原指数计算方法进行SS2溶血素B细胞表位预测。结果推测最有可能的B细胞表位位于溶血素N端第74～85、231～244区域位。结论应用多参数预测SS2溶血素的特征,为表位疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。