斑点叉尾鮰出血病病毒疫苗的研究

斑点叉尾鮰病毒性出血病是严重困扰着斑点叉尾鮰养殖业发展的一大疾病,主要是由疱疹病毒病引起的。通过对病鱼组织进行捣碎、离心、灭菌、灭活等步骤之后制备出疫苗,将制备的疫苗再用斑点叉尾鮰进行安全与毒理试验。结果表明,给体长10cm左右的小鱼注射0．1mL的疫苗比较适合,保护率为70％。     

斑点叉尾鮰病毒性疾病综述

综述了斑点叉尾鮰病毒病的流行情况、临床症状,论述了影响疾病爆发的因子、诊断、治疗、控制和预防措施。     

斑点叉尾鮰病毒性疾病综述

本文综述了斑点叉尾鮰主要的病毒性疾病的流行情况、临床症状、诊断和治疗措施等,以期为斑点叉尾鮰的养殖生产和疾病防治提供参考依据.     

斑点叉尾鮰人工繁殖实验

我们于1989年开始进行斑点叉尾鮰的人工繁殖试验研究，现将试验情况报告如下。     

红色和黑色斑点叉尾鮰人工繁殖试验

通过人工控制手段,促使红色斑点叉尾鮰与黑色斑点叉尾鮰自行配对、产卵、收集受精卵集中孵化,获得浅黑色的鱼苗;要获得稳定的红鮰鱼苗,必须采取红色斑点叉尾鮰自交的方法。     

网箱饲养斑点叉尾鮰出血病防治试验

斑点叉尾鮰属鲶形目鮰科鱼类,原产于美国。该鱼体形较长,体表光滑无鳞,尾鳍分叉较深,背部浅灰黑色,腹部乳白色,体两侧有不规则的浅黑色斑点,有触须4对,具脂鳍,为广温性鱼类。推广养殖表明其生长迅速,适应性广,群体产量高,特别适合网箱养殖。近年来,我市网箱养殖斑点叉尾鮰越来越普遍,先后建立     

广西地区斑点叉尾鮰人工繁殖试验

从池塘养殖的成鱼中选择亲鱼，培育至3龄以上，自然受精、人工孵化。4月上旬获第1批受精卵，经4d室内孵化。出苗36万尾，培育至7～8cm 32．4万尾，成活率达90％。比湖北地区产苗时间提前1个多月。     

斑点叉尾鮰亲鱼的运输

2000年3月30日,将美国密西西比品系原种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctalus)亲鱼,自湖北荆州张家山渔场运往辽宁铁岭三家子渔场.起运亲鱼698尾共1 087kg,经20 h到达目的地,成活率97.9%.     

斑点叉尾鮰病毒“自杀性”ＤＮＡ疫苗的构建及其体外表达检测

根据CCVORF6基因序列,设计合适的引物,扩增ORF6基因,分别将其克隆到"自杀性"DNA疫苗载体pS-FV与常规DNA疫苗载体pcDNA3.1(+)中,转化感受态细胞DH5α后提取质粒,构建斑点叉尾鮰(Ictalurus punc-tatus)"自杀性"DNA疫苗ps-ORF6与常规DNA疫苗pcd-ORF6,利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行PCR扩增、提取质粒酶切鉴定以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。将重组质粒转染人胚肾细胞(293T),间接免疫荧光试验表明ORF6均获得表达,但"自杀性"DNA疫苗的表达效果不如常规DNA疫苗,该研究为这2种疫苗进一步的鱼体试验奠定了基础。     

斑点叉尾(鱼回)急性流行性传染病的病原分离与病理学观察

对2004-2005年四川发生的斑点叉尾鲴（Ictalunes punctatus）急性流行性传染病进行病原学和病理学研究，从自然发病的斑点叉尾鲴肝、肾分离到1株致病菌（CCF00024）。经人工感染实验证实该菌为斑点叉尾鲴急性流行性传染病的病原菌。根据其形态和生理生化特性鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。病鱼的眼观病变主要表现为体表（特别是腹部和下颌）充血、出血和褪色斑，腹部膨大，腹腔内充有淡黄色或带血的腹水，胃肠道黏膜充血、出血，肠道发生套叠，甚至肠脱，肠腔内充满淡黄色或含血的黏液。组织学病变主要表现为全身组织器官广泛性水肿，出血、变性、坏死，以及中性白细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，特别是骨骼肌、肝、脾、肾和胃肠道的损伤较为严重。细胞病理学表现为，病鱼肝、脾、肾肠道等器官的细胞均有较为严重的损伤，细胞肿胀，超微结构被破坏，特别是线粒体和细胞核的损伤明显。线粒体表现为肿胀，嵴断裂或溶解消失，呈空囊状；细胞核变形，染色质溶解或发生浓缩、裂解边移，甚至形成类似凋亡小体的结构。[中国水产科学，2007，14（3）：457—465]     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾■(Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定...     

斑点叉尾急性流行性传染病的病原分离与病理学观察

对2004-2005年四川发生的斑点叉尾(Ictalunes punctatus)急性流行性传染病进行病原学和病理学研究,从自然发病的斑点叉尾肝、肾分离到1株致病菌(CCF00024)。经人工感染实验证实该菌为斑点叉尾急性流行性传染病的病原菌。根据其形态和生理生化特性鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。病鱼的眼观病变主要表现为体表(特别是腹部和下颌)充血、出血和褪色斑,腹部膨大,腹腔内充有淡黄色或带血的腹水,胃肠道黏膜充血、出血,肠道发生套叠,甚至肠脱,肠腔内充满淡黄色或含血的黏液。组织学病变主要表现为全身组织器官广泛性水肿,出血、变性、坏死,以及中性白细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润,特别是骨骼肌、肝、脾、肾和胃肠道的损伤较为严重。细胞病理学表现为,病鱼肝、脾、肾肠道等器官的细胞均有较为严重的损伤,细胞肿胀,超微结构被破坏,特别是线粒体和细胞核的损伤明显。线粒体表现为肿胀,嵴断裂或溶解消失,呈空囊状;细胞核变形,染色质溶解或发生浓缩、裂解边移,甚至形成类似凋亡小体的结构。     

斑石鲷irf7基因克隆及其在病毒感染下的表达

为探究斑石鲷(Oplegnathus punctatus)干扰素调节因子irf7在虹彩病毒(Iridovirus)感染过程中的作用机制,本研究通过PCR扩增获得了斑石鲷irf7基因CDS区序列,对其序列特征进行分析,并在组织水平和细胞水平研究该基因在病毒感染中的表达模式。结果显示,Opirf7基因CDS区全长为1332 bp,编码443个氨基酸的多肽,具有干扰素调节因子家族的保守结构域。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,Opirf7基因在健康个体的不同组织中均有表达,在肝脏中表达量最高,在皮肤和肠等免疫组织中的表达量也较高。对斑石鲷腹腔注射虹彩病毒诱导抗病毒免疫反应,在组织水平检测Opirf7对病毒感染的响应模式。与对照组(0 h)相比,Opirf7在免疫组织中的表达水平有不同程度的升高。在细胞水平,建立poly I: C感染的斑石鲷脑细胞系模型,利用qRT-PCR检测Opirf7的表达变化。结果显示,poly I: C刺激后,脑细胞系Opirf7的表达量显著升高。结果表明,Opirf7在斑石鲷抗病毒病的免疫应答过程中发挥重要作用。     

病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10~(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。     

鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原。NNV为单一正链、2节段RNA病毒,基因组由RNA1(3.1 kb)和RNA2(1.4 kb)组成。在病毒复制过程中,会合成亚基因组RNA3。RNA1编码RNA聚合酶。RNA2编码衣壳蛋白,为病毒的唯一结构蛋白。RNA3编码B1和B2两种非结构蛋白。根据病毒衣壳蛋白的基因序列,神经坏死病毒可以分成4种基因型,分别为拟鲹、红鳍东方鲀、条斑星鲽和赤点石斑神经坏死病毒基因型。但是,目前只发现A、B、C三种病毒血清型,A对应拟鲹神经坏死病毒基因型,B对应红鳍东方鲀神经坏死病毒基因型、C对应条斑星鲽神经坏死病毒和赤点石斑神经坏死病毒基因型。病毒存在垂直和水平两种传播途径,而且广泛分布于养殖和野生鱼类中。阻断病毒在野生与养殖鱼类之间的传播和开展新型鱼类疫苗研发是将来研究趋势。     

草鱼出血病基因疫苗的免疫效果

为探讨含有草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP6基因的重组基因疫苗对草鱼出血病的免疫效果,将重组基因疫苗分别配制为10、30和60μg三个梯度,同时设30μg pFastBacTMDual空载体组,均以等体积的氢氧化铝佐剂为免疫增强剂,对草鱼进行注射,以未经处理的草鱼作为对照组。定期采血测定抗体效价,最后对各组草鱼进行攻毒试验并计算死亡率和免疫保护力。结果显示：注射疫苗的三组草鱼均产生抗体,10μg组效价为1：6～1：11;30μg组为1：9-1：13;60μg组为1：11-1：17,且各组效价均在第28天测定最高,免疫保护率依次为100％、100％和95％,而空载体组和对照组为70％和0％。研究表明,疫苗能够诱导草鱼产生免疫反应,为草鱼出血病核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。     

Construction of KHV‐CJ ORF25 DNA vaccine and immune challenge test

KHV ORF25 fragments were cloned from Koi Herpes Virus‐CJ (KHV‐CJ) strains isolated in our laboratory. The amplified products were inserted into the eukaryotic expression vector pIRES‐neo, forming recombinant plasmid pIRES‐ORF25. The recombinant plasmid pIRES‐ORF25 at 1 μg per koi, 10 μg per koi and 50 μg per koi was intramuscularly injected into healthy kois, respectively. The results showed that the recombinant pIRES‐ORF25 could induce the production of specific antibodies in koi determined by indirect ELISA. The differences of immune effect between three doses were not significant (P > 0.05), but all of them could induce the production of neutralizing antibodies. The immune challenge test showed that the mortality of koi injected with PBS, blank pIRES‐neo vector and nothing was 90%, 92.5% and 85% at 25 days. While the mortalities of koi injected with eukaryotic expression plasmid pIRES‐ORF25 were 20%, 17.5% and 12.5%. Differences in comparison with the control group were highly significant (P < 0.01). Histopathological staining revealed that the tissues of the immunized koi did not change apparently. In conclusion, the DNA vaccine pIRES‐ORF25 construct could well protect koi against KHV and had the potential to be applied in practice.     

鱼类病毒性出血性败血症病毒基质蛋白的原核表达及其亚细胞定位

为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。