鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒ＧＤ－Ｐ１分离株Ｆ０裂解位点附件８８４ｂｐ的Ｆ基因ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒中,获得了重组质粒Ｔ－ｐＰＭＶ－Ｆ－Ｉ,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株Ｆ４８Ｅ９和ＨＥＲ／３３相应区域的同源性分别为８７．５％和８８．１９％,与新城疫病毒弱毒株ＬａＳｏｔａ和Ｂ１株的同源性分别为８３．８３％和８４．１５％。该病毒Ｆ０裂     

牛冠状病毒4H12/1D4单链基因片段在大肠杆菌中的表达

用ＥｃｏＲＩ酶切ＰＲ５Ｂ４质粒，采用“Ｖ”字形内槽电洗脱法回收约０．８０４Ｋｂ牛冠状病毒基因工程抗体４Ｈ１２／１Ｄ４单链基因片段，并将其插入载体质粒ＰＥＴ－１７ｂ的ＥｃｏＲＩ位点构成重组质粒ＰＥＴ－Ｄ４，将重组质粒转化ＤＨ５α感受态细胞，在ＩＰＴＧ的诱导下表达，细菌裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳筛选，发现含ＰＥＴ－Ｄ４细菌经诱导新增一条约２８ＫＤα蛋白带，该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符，经光密度扫描，表达量约占菌体总蛋白的１４％     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF5基因的克隆及序列分析

本研究利用对应于ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ－２３３２株及ＬＶ株ＯＲＦ５基因保守序列的１对均为２５个碱基的引物１００５ＰＳ、１００６ＰＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增出了包括完整ＯＲＦ５基因的ＤＮＡ片段,片段长约７３０ｂｐ。将此片段定向克隆入ｐＵＣ１８载体的ＥｃｏＲＩ和ｓｔＩ位点之间,获得了Ｂ１３ＯＲＦ５基因与ｐＵＣ１８载体的重组质粒。通过ＥｃｏｒＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏｒＩ／ＨｉｎｄⅢ     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

FPV282E4株BamHI7．3kb片段的亚克隆

选用ＦＰＶ２８２Ｅ４株ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ含非必需区片段，经ＸｂａⅠ酶切，将Ａ、Ｂ、Ｃ３个片段亚克隆于ＫＳ（—）质粒中，同时使Ｄ片段自身环化，获得ＫＳＦａ、ＫＳＦｂ、ＫＳＦｃ、ｐＵＣＦｄ４个重组克隆，经酶切鉴定证明亚克隆正确。为以ＦＰＶ基团组非必需区的ＢａｍＨＩ７．３ｋｂ片段中ＢｇｌⅡ片段所在区域构建重组载体质粒和体内重组表达外源基因的研究以及非必需区的核苷酸序列分析奠定基础     

根癌农杆菌介导的mMT-IcDNA转化枸杞及其表达的研究

报道了小鼠金属硫蛋白－ＩｃＤＮＡ通过根癌农杆菌介导转入枸杞,并在枸杞体内表达产生富集锌的转基因枸杞。用带有嵌合ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ及ｃａＭＶ３５ｓ启动子的含非致癌性Ｔｉ质粒载体的概癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｃａＭＶ３５ｓ：ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ：ｎｏｓ）感染枸杞幼茎外植体,在含有Ｋｍ１００μｇ／ｍｌ和Ｚｎ＾２＋５０μｍｏｌ／Ｌ的选择培养基上筛选转化的愈伤组织,并在含Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ,Ｚｎ＾２＋１００μｍ     

应用RT-PCR和RFLP分析肾型鸡传染性支气管炎病毒基因型

对来自浙江省３个不同地区的肾型鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ－ＪＤ,ＤＱ,ＨＹ）和参考株Ｈ１２０,通过蛋白酶Ｋ－ＳＤＳ处理、酚－氯仿法抽提基因组ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到了预期为１．７２ｋｂ的Ｓ１蛋白基因ｃＤＮＡ,用限制性内切酶ＨａｅⅢ,ＰｓｔＩ,Ｋｓｐ６３２１对Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行ＲＦＬＰ分析。结果表明ＪＤ,ＤＱ,ＨＹ毒株的ＲＦＬＰ带型相同,但与经典的肾型ＩＢＶ代表株（即Ｔ株、Ｇｒａｙ株、Ｈｏ     

云南烟草花叶病毒54KD基因的分离,克隆及序列分析

从云南省弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝，植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ），在红花大金元品种中以ＴＭＶ普通株作对照进行致病力测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒ＲＮＡ云南强毒株系为模板。根据国内外研究结果自行设计、合成寡核苷酸引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ体外扩增，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ克隆，获得了云南烟草５４ＫＤ（ＴＭＶ复制酶）全基因片段，顺序分析表明     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ,并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。     

LacZ基因在小鼠骨骼肌中表达的时─空模式

以ＬａｃＺ为报告基因,利用ＤＮＡ重组技术构建了ＬａｃＺ真核表达质粒ｐＣＤＬａｃＺ,ｐＣＤＬａｃＺ肌注小鼠后,Ｘ－Ｇａｌ染色法及半乳糖苷酶定量分析结果表明,ＬａｃＺ基因在小鼠胫前肌中得到表达,并在肌注后第７天左右达到高峰,表达的ＬａｃＺ主要分布于胫前肌近膝关节肌腱结合处,提示肌肉接种基因疫苗应采用纵向,接种部位应接近肌腱结合处。     

家蚕Y,Nl基因和Z染色体的RAPD分子标记研究

利用ＲＡＰＤ技术，对转座黄血（Ｗ＾Ｙ）系统Ｙ０１０，Ｘ射线诱发染色缺失的第１无半月纹Ｍｌ系统，伴性赤蚁油蚕（Ｚ＾ｓｃｈｏｄＺ＾ｓｃｈｏｄ）与７８２（Ｚ＾＋＋Ｗ）的Ｐ１，Ｐ２及Ｆ１，ＲＦ２进行了多态性分析，结果表明，通过６０、１２０和２０５个随引物的扩增，获得了与Ｗ＾Ｙ连锁的ＯＰＧ－０３６５０与Ｎｌ＾ｌ连锁的ＯＰＡ－０８４８０和Ｚ＾＋＋连锁的３个ＲＡＰＤ标记，初步讨论了ＲＡＰＤ技术在家蚕分子标记寻找     

鸡产蛋下降综合症（EDS—76）Z16毒株的分离和鉴定

从５个爆发产蛋下降综合的鸡场收集８０个样品中，分离到５株具血凝性的病毒，命名为ＣＡＶ－Ｚ１６、Ｚ２、Ｗ４、Ｔ１和Ｔ３株。病毒大小７０－８０ｎｍ，无囊膜，二十面体对称；对氯仿不敏感，ＰＨ３－５下稳定，５０～６０℃１小时不被实例灭活；在ＤＥＦ细胞上繁殖能被ＩＵＤＲ抑制；经血凝抑制试验、琼扩试验和微量中和试验证实与ＡＶ－１２７株属同一血清型，鉴定为ＥＤＳ－７６病毒。ＣＡＶ－Ｚ１６株能在鸭胚上繁殖，致死鸭     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

通过根癌农杆菌介导法获得新疆甜瓜抗病优质新品系

用新疆甜瓜无菌苗子叶块,通过根癌农杆菌介导法,将黄瓜花叶病毒外壳蛋白ｃＤＮＡ基因导入“新红心脆”等６个品种（系）,经卡那霉素筛选,获得大量Ｋｍ抗性植株,其中部分Ｋｍ抗性植株经Ｌｕｉｓ法检测,表达了胭脂碱合成酶活性。进一步经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ＤＯＴ－Ｅｌｉｓａ,ＰＣＲ特异扩增。Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法检测,结果证明了Ｋｍ抗性植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因,长度为１ｋｂ,并能有效表达,表达产     

新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特性研究(初报)

以伪狂犬病病毒Fa株为起始材料 ,构建的 pp6 3LacZ转移载体质粒与PRVFaDNA经磷酸钙转染 ,在MDBK细胞内同源重组获得PRVFagE-/gI-/LacZ基因缺失株。以PDTK3 - 6 ,5 - 6TK缺失质粒与上述基因缺失株在TK-143细胞内同源重组 ,获得PRV -SA2 15等三基因缺失株。经核酸杂交证实构建是成功的。生物学特性观察显示 ,该基因缺失株对多种动物安全 ,具有良好的免疫原性 ,有望成为一株优秀的PRV疫苗候选株。     

人参皂甙对酵母菌中β—半乳糖甙酶诱导的影响

研究了红参皂甙（总皂甙，皂甙组分Ｒｂ１和Ｒｇ１）对酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中的β－半乳糖甙酶诱导的影响，认为人皂甙将穿过细胞膜，在细胞核中起甾体激素作用。为了达到这一目的，把包含ＣＡＬ１启动子的ＥｃｏＲＩ的ＤＮＡ片段（６８５ｂｐ）插入到质粒ＹＥｐ３５６（７．９６６ｋｂ）的ＬａｃＺ基因上游的多酶切点，假设由此产生的质粒ＰＧＡＬ１－ＬａｃＺ在半乳糖存在下仅表达β－半乳糖     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ－２－ＵＫ分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

马立克氏病病毒Ⅰ型疫苗毒克隆株pp38基因同源物的扩增和克隆

用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术,从马立克氏病病毒（ Ｍ Ｄ Ｖ） Ｃ Ｖ Ｉ９８８／ Ｃ 株感染的鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ）基因组 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出含起始密码子的 Ｍ Ｄ Ｖ ｐｐ ３８ 基因同源物编码序列。在以 Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ （ Ｄｉｇ．）标记的 ｐｐ３８ 基因作为探针,在 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中,该探针能识别该 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增片段。将该 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增片段在 Ｂａｍ ＨⅠ和 ＰｓｔⅠ位点克隆进 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体,酶切分析筛选到含 ｐｐ３８ 基因同源物的重组质粒并进行了全序列分析,证明该重组质粒是 ｐｐ ３８ 基因同源物克隆。