牛源大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感突变株中被转座子破坏的基因包括ecs4206(磷酸核酮糖激酶)、ecs3959(β-D-半乳糖苷酶β亚基)、ecs3946(假定蛋白)和ecs1857(DNA结合转录调控因子)。筛选出的基因可被开发为控制或扭转大肠杆菌耐药性的作用靶点。     

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”) Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISP...     

多重耐药大肠杆菌中前噬菌体的分布特征及诱导分离

[目的]通过调查前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中的分布特征、诱导分离以及前噬菌体中耐药基因与毒力基因的流行状况,为研究前噬菌体介导耐药基因在细菌的传播提供科学依据.[方法]挑选前期保存的2018-2019年广东省分离的131株禽源多重耐药大肠杆菌进行核酸提取及全基因组测序,将二代测序的结果组装拼接成全基因组序列,上传至噬菌...     

金鱼源维氏气单胞菌JY01全基因组测序及生物信息分析

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii JY01)是从福州某养殖场内金鱼烂尾、腐皮和溃疡等病灶处分离出的1株革兰氏阴性优势菌。为了解其基因组结构及功能特征,基于IlluminaPE150和Pacbio测序平台对维氏气单肥菌菌株JY01进行全基因组测序,并对测序数据进行组装和组分分析,利用生物信息学手段进行基因预测与功能注释、同时预测致病因子和耐药基因。结果表明:维氏气单肥菌菌株JY01基因组序列长度为4.97Mb,GC含量为58.17%;共预测到4 601个编码基因、31个rRNA、16个基因岛及124个tRNA;其中,3 461个基因在COG中获得注释,3 082个基因聚集到GO聚类分析中,4 345个基因在KEGG代谢通路中富集,预测维氏气单胞菌菌株JY01携带13种毒力因子包含240个相关毒力基因及9大类抗生素耐药性包含175个抗生素耐药基因。     

微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体的构建及表达

目的构建微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体并表达蛋白,为研究微小脲原体的生物学特性提供依据。方法根据NCBI上的微小脲原体核糖体蛋白L23基因序列设计引物,以微小脲原体基因组DNA为模板,通过PCR扩增目的基因后进行纯化,利用限制性内切酶BamH I和Not I对原核表达载体pGEX-6P-2和目的基因进行双酶切,并通过T4连接酶连接,连接产物转化XL1-Blue感受态细菌后接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基培养,对形成的菌落进行PCR筛选和质粒测序验证,利用IPTG诱导表达GST融合蛋白,表达产物超声裂解后经GST Sepharose 4B纯化,SDS-PAGE电泳鉴定。结果经PCR成功克隆出目的基因,全长345bp,使用pGEX-6P-2质粒通用引物对转化有连接产物的大肠杆菌菌落进行PCR筛选鉴定,阳性菌落的PCR条带大小为468bp,与预期相符,对筛选出的菌落扩大培养并提取质粒进行基因测序,测序结果与NCBI中的基因序列完全一致,对诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白分子量质约为36.6kD,与预期一致。结论成功构建了微小脲原体核糖体蛋白L23原核表达载体,并在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达,为微小脲原体核糖体蛋白L23基因以及解脲脲原体的后续研究奠定了基础。     

鸡源沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

[目的]从沙门氏菌全基因组范围筛选和鉴定其与β-内酰胺类抗生素耐药性相关的基因.[方法]对临床分离的10株沙门氏菌进行药敏试验,选择耐药性最广泛的菌株作为研究对象,利用mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,筛选文库中对β-内酰胺类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]从突变株文库中筛选得到15株分别对青霉素G、氨苄西林和头孢哌酮敏感的突变株,其中3株对三种抗生素都敏感.转座子破坏基因为STM4216 (inner membrane protein)和STM4150 (50S ribosomal protein L1).[结论]筛选出的基因有望成为控制或扭转沙门氏菌耐药性的作用靶点.     

2株兔出血症病毒全基因测定与遗传进化分析

对2株兔出血症病毒(RHDV)SCH04、Sch07进行全基因组序列测定,并进行同源性及遗传进化分析。按照病毒核酸组成,将病毒基因分7段进行RT-PCR扩增,将分段扩增产物分别克隆到p MD-19T载体进行测序,用DNAStar进行拼接,得到全基因组序列;参照Gen Bank上登陆的31株RHDV毒株全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列以及ORF2编码基因核苷酸序列对2株病毒进行同源性和遗传进化分析。结果显示,SCH04基因组全长7 439 bp,Sch07基因组全长7 438 bp,2株病毒全基因的核苷酸序列同源性为99.8%,与31株参考毒株全基因的核苷酸序列同源性为78.3%~97.0%;2株病毒的VP60基因核苷酸序列同源性为99.7%,ORF2编码基因核苷酸序列同源性为99.2%。进化树显示2株病毒同属于抗原变异株RHDVa(GI.1a)基因群,且亲缘关系最近。VP60基因核苷酸序列与ORF2编码基因核苷酸序列均可以作为RHDV遗传进化分析。     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

林麝肺源ST1249型铜绿假单胞菌的分离鉴定及其全基因组序列分析

【目的】对分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌(PA)进行鉴定,并分析其致病和耐药机制,为林麝PA感染化脓性疾病的防控奠定基础。【方法】将病原菌分离纯化后,依次进行生化试验、16S rRNA序列分析、药敏试验和小鼠致病性试验,并通过全基因组测序,对分离菌株进行群体进化和物种分型分析以及基因功能注释。【结果】分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌经鉴定与PA相符,命名为FMDP001。药敏试验显示其对阿莫西林、头孢曲松、氨曲南、多粘菌素B和林可霉素耐药;对小鼠半数致死量为9.4×10~5 CFU/mL。全基因组序列分析显示该菌基因组大小为6 955 100 bp,序列类型为ST1249,与B136-33株同源性最高,且两菌株基因组平均核苷酸一致性(ANI)值达98.93%;全基因组中共有357个序列编码FMDP001与致病性相关的基因,根据功能分为黏附、铁摄取、胞外毒性蛋白和调控系统;84个序列编码耐药基因,其中多药耐药外排泵为主要成分。【结论】从林麝化脓肺脏中分离到1株致病性较强的PA,并获得ST1249型林麝源PA的全基因组序列,序列显示该菌携带大量药物外排泵及生物膜形成相关基因,决定其具有多重耐药特性,哌拉西林等可作为该类型PA感染的临床用药。     

耐恩诺沙星沙门菌gyrA和gyrB基因的分子特征分析

为了探究临床分离的沙门菌对恩诺沙星的耐药机制,通过微量肉汤稀释法测定18株临床分离的沙门菌对恩诺沙星的敏感性,然后选取其中对恩诺沙星耐药的菌株,利用PCR扩增其gyrA和gyrB基因,并将扩增产物进行序列测定,最后用DNAMAN软件将测序结果与NCBI上公布的沙门菌标准野生型菌株(LT2)的gyrA和gyrB基因序列进行比对分析。结果显示,18株临床分离的沙门菌中有4株为耐药菌株,耐药率22.2%。对4株耐药菌株的gyrA和gyrB基因比对分析发现,gyrB基因未见突变,而gyrA基因有3个氨基酸位点突变,分别是Ser83→Phe或Leu(突变率100%)、Asp87→Asn(突变率75%)、Asn200→Asp(突变率25%);其中恩诺沙星最小抑菌浓度(MIC)≥16.000μg/mL的3株菌均是在83、87位出现双突变,而恩诺沙星MIC为4.000μg/mL的1株菌则是在83、200位出现双突变。结果表明,沙门菌对恩诺沙星产生耐药性与gyrA基因的突变密切相关,gyrA基因喹诺酮耐药区(QRDR)的双突变可使沙门菌对恩诺沙星的耐药性增强,提示Asp87的突变可能增强了Ser83位点突变所介导的耐药性,但非QRDR区的Asn200不能发挥增强耐药性的作用。     

西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类抗生素耐药靶位突变分析

掌握西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类药物的敏感性及其耐药机制,为牛支原体病的临床治疗与预防提供依据。本研究通过微量稀释法对10株牦牛源牛支原体进行了氨基糖苷类药物敏感性与耐药性试验,并对敏感株进行体外高度耐药诱导,同时分别提取敏感株、临床耐药株和体外诱导高度耐药株基因组进行氨基糖苷类药物耐药基因靶位分析与药物主动外排系统研究。结果显示,敏感株和耐药株在靶位基因中未检测到相应位点的碱基突变,体外诱导高度耐药株M.bovis 3和M.bovis 7发生了A1409G基因位点突变,M.bovis 1和M.bovis 5发生了A1409G和C1192T基因位点突变,M.bovis 4和M.bovis 9发生了A1408T和C1192T基因位点突变;经药物主动外排系统检测分析,结果显示,西藏牦牛源牛支原体不存在以氨基糖苷类抗生素为底物的主动外排系统。研究结果表明,西藏牦牛源牛支原体不同分离株对氨基糖苷类药物敏感性存在较大差异,其耐药菌株的产生可能与临床长期使用单一抗生素有关。体外诱导高度耐药株对大观霉素、卡那霉素和庆大霉素产生高度耐药的原因是其耐药基因发生碱基突变,但碱基突变在牛支原体对氨基糖苷类...     

肾型IBV陕西分离株 CK/ CH/ Shaanxi/ 2009/ H09全基因的克隆与序列分析

为了解鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西流行株的分子生物学特征,参考DY07株全基因核苷酸序列设计22对引物,采用RT PCR方法对西北农林科技大学动物医学院禽病研究室分离的1株肾型IBV陕西分离株CK/CH/Shaanxi/2009/H09的全基因进行分段扩增并测序,将测序成功的各序列依次拼接,得到全基因序列后进行序列比对分析。研究结果表明,该分离株基因组全长27 675 bp,共有10个开放阅读框,其基因排序为5′cap Replicase S 3a 3b 3c M 5a 5b N poly（A）3′,纤突蛋白裂解位点为到⁵³⁶RRFRR⁵⁴⁰, 3a、5a和N基因的大小与参考毒株相比是保守的,但编码其他蛋白的基因长度存在差异;同源性分析结果显示,该毒株与48个参考毒株的同源性为85.2%~93.5%;系统进化树分析结果显示,该毒株与中国分离株ck/CH/LDL/091022、YX10株和DY07 株的亲缘关系较近,同属于中国近年来主要流行的血清型毒株,但在基因水平上已经产生一定程度的变异。     

鸡肠道大肠杆菌多抗菌株C20耐药性基因的预测和分析

为揭示动物源大肠杆菌耐药性机制,追踪潜在的抗性基因传播机制及其来源,在先前公布的分离自鸡肠道的多抗耐药性菌株大肠杆菌Escherichia coli C20基因组基础上,对E.coli C20抗生素抗性基因种类、数量、来源及其耐药性机制进行分析。通过与已知的抗生素抗性基因数据库进行对比和注释,一共预测和注释了80个潜在的耐药性基因,包括与先前筛选的7种抗生素抗性对应的抗性基因。其中,喹诺酮类抗生素抗性基因位于C20基因组上,四环素、磺胺类、氯霉素、氨基糖苷类以及大环内酯类抗生素的抗性基因则位于C20环状质粒分子上。基因组聚类分析表明,菌株C20与大肠杆菌K-12菌株DH1、BW2952和MG1655亲缘关系较近,序列相似性97%~99%。3株K-12菌株基因组中没有发现与C20质粒类似的序列,表明C20菌株的抗性基因主要是通过质粒介导的水平基因转移方式从其他环境微生物中获得。     

野猪、家猪及其杂种猪ACSL4基因部分内含子的克隆和多态性分析

克隆猪ACSL4基因的内含子3和5,寻找其SNP位点。通过酚-氯仿法从野猪、家猪及其杂种猪的耳组织中提取基因组DNA。根据GenBank网站的猪ACSL4基因cDNA全序列设计两对引物进行PCR扩增,利用PCR-SSCP对获得的序列进行了多态性分析。对猪基因组进行PCR扩增,对获得的内含子3(232 bp)和内含子5(241 bp)序列进行克隆和测序,结果表明,基因片段分别是包含部分外显子3、4,完整的内含子3序列和部分外显子5、6,完整的内含子5序列,与人的该基因分别有72.87%和78.62%的同源性。多态性分析发现,该基因的两个内含子较为保守,未检测到多态位点。该研究为深入探讨该基因与肉质性状的关系以及丰富猪的种质资料库和分子育种提供了理论依据。     

猪细小病毒6型全基因组克隆及遗传进化分析

对猪细小病毒6型(PPV6)安徽分离株PPV6 AH进行全基因组序列克隆,并进行遗传进化树构建及同源性分析。将病毒基因分10段进行PCR扩增并测序,用SeqMan进行拼接,获得全基因组序列。将PPV6 AH株与GenBank中PPV6其他毒株进行遗传进化分析。结果显示,PPV6 AH基因组全长6 180 bp,与其他国内外15株PPV6全基因的核苷酸序列同源性达到97.1%～99.5%。基于PPV6全基因、NS1及Cap基因构建的遗传进化树显示PPV6 AH株与PPV6 BJ、BJ2、SC及JS株有着共同的进化起源。NS1基因第708、996、1 932核苷酸位点发生突变;Cap基因在第1 205、1 211、1 582、1 614核苷酸位点发生突变;Cap蛋白氨基酸在第402和404位点发生突变。本研究首次报道PPV6在安徽省猪群中存在,该研究结果为安徽地区PPV6的分子遗传进化特征提供了一定的参考。     

利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法，本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析，基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点，通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数，最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb，Q20为96.1%，Q30为89.2%，能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2，平均测序深度为80×，reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀，测序的随机性比较好，可以进行后续分析；2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036，平均测序深度为140×，嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点，位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255；3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×，T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×，而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×，Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×，同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍，这表明T-DNA为单拷贝，与发现一个插入位点的结果相符合；4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台，也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。     

福建地区鸡滑液囊支原体的分离、药物敏感性及耐药株全基因组序列分析

2018年自福建省疑似鸡滑液囊支原体感染病鸡中分离得到9株鸡滑液囊支原体,采用微量肉汤稀释法测定了其对9种抗菌药物的敏感性,对筛选出的多重耐药株(MS HB)进行了全基因组序列分析.结果显示,福建地区鸡滑液囊支原体临床株对泰万菌素和泰妙菌素较为敏感,对泰乐菌素、多西环素、土霉素和替米考星敏感性次之,而对氟苯尼考和恩诺沙星最不敏感.多重耐药株(MS HB)基因组大小为766081 bp;GC含量为28.02％;共注释到1464个基因,其中,包括多个毒力基因和1个耐药基因(ermQ),与敏感标准株WVU1853全基因组序列比对得出大环内酯类和氟喹诺酮类药物耐药基因的多个突变位点.研究结果丰富了对鸡滑液囊支原体流行病学的认识,并可为该地区临床治疗鸡滑液囊支原体感染的合理用药选择提供理论依据和实践指导.     

上海地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌基因分型与耐药性研究

通过对分离自上海4个规模化奶牛场的63株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行基因分型和耐药性分析,研究金黄色葡萄球菌基因型在上海地区的分布情况及其耐药情况,并分析基因型和耐药性两者之间的相关性。结果显示,利用RAPD技术对63株金黄色葡萄球菌进行基因分型,共分为9个基因型,其中以Ⅵ型为主,占总数的47.62%。各个奶牛场的基因型分布差异显著,Z奶牛场和D奶牛场基因型分布较平均,而W奶牛场和X奶牛场基因型分布较集中。63株金黄色葡萄球菌对各种常用抗生素均产生不同程度的耐药性,尤其对氨苄西林和阿莫西林已完全耐药,各个奶牛场的菌株对不同抗生素的耐药性差异较大。对金黄色葡萄球菌的基因型和耐药性进行比较发现两者之间没有显著的相关性。     

嗜水气单胞菌喹诺酮类药物抗性决定区基因片段的克隆与突变分析

将分离到的4株对环丙沙星，诺氟沙星和氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药的嗜水气单胞菌、2株敏感菌，进行旋转酶基因A亚单位（gyrA)喹诺酮抗性决定区基因（QRDR）PCR扩增。引物序列A1:agagttcctatcttgattacg;a2:ctgtgatgtaggtcatcaact，在gyrA基因中的位置分别为53-73和620-640。PCR扩增后，将扩增产物克隆到pMD-18T载体，酶切鉴定后测序。用DNAstar软件分析比较其蛋白序列，发现4个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser-Ile（4株耐药菌），92位点的Leu-Met(4株耐药菌），174位点的Ile-Phe(3株耐药菌），202、203位点的Asn、Leu-Asp、Arg（3株耐药菌，另1株Leu未突变）。83位点的突变与大肠杆菌等一致，122位点具有保守的Try，耐药菌突变后的氨基酸残基分子量均比对应增大。4株耐药菌、2株敏感菌的喹诺酮抗性决定区基因片段序列巳登录GenBank，注册号AY039655，AY039656，AY138539，AY138540，AY138537，AY138538。     

一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌SWUN5815全基因组测序及序列分析

旨在分析一株牦牛源植物乳杆菌SWUN5815的全基因组序列测序,并对该菌株的功能特性基因进行挖掘.基于PacBio RSII测序平台对乳杆菌SWUN5815进行全基因组测序分析和GO、KEGG、COG和NR数据库进行基因组基本功能注释.结果 表明:1)植物乳杆菌SWUN5815的基因组大小为3.27 Mb,GC含量44...