浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

落叶松杂种与亲本ISSR鉴别技术

以兴安落叶松（Larix gmelini）、长白落叶松（Larix olgensis）和日本落叶松（Larix Kaempferi）及其杂种子代当年生嫩叶为研究材料,采用ISSR分子标记技术对落叶松亲本与杂种进行了鉴别.结果表明:用ISSR16和ISSR19号引物扩增的特异条带能够分别鉴别兴安落叶松×长白落叶松杂交种和...     

桉树焦枯病菌巢式聚合酶链反应快速检测方法的建立与应用

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。     

小麦抗叶锈基因Lr34的RAPD分析

在建立了适合本实验室的RAPD反应体系基础上,用120个随机引物对含抗病基因Lr34小麦品种和感病品种Thatcher进行了RAPD分析.68个引物均能扩增出可辨条带,其中S22扩增出1条660 bp特异性条带,S130扩增出1条2 000 bp特异性条带,S503扩增出1条500 bp特异性条带.S22和S503在实验中获得较好的重复性,并将其产物命名为S22-660和S503-500.     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

梨轮纹病和炭疽病病原菌PCR检测

为建立梨轮纹病原菌和炭疽病病原菌的分子检测方法,根据GenBank上炭疽病原菌和轮纹病原菌不同种的ITS序列差异设计2对引物TJ1/TJ2和LW1/LW2,对2种病原菌菌株进行扩增,比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度,并对果园中接种梨轮纹病原菌的梨果实进行检测。结果表明,建立的PCR体系可分别从炭疽病原菌和轮纹病原菌菌株扩增出317 bp和325 bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍,且可以在接种较低浓度(1 ml 10个)轮纹病原菌孢子液7 d后的梨果实组织中检测到病原菌。说明使用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病原菌在果园的种群消长动态。     

落叶松八齿小蠹伴生真菌富士长喙壳的防治研究

筛选落叶松八齿小蠹伴生真菌富士长喙壳(Ceratocystis fujiensis)的拮抗菌株和杀菌剂,旨在为该伴生真菌的生物防治和化学防治提供科学依据。通过22个菌株与3株富士长喙壳(CF1、CF2、CF3)的拮抗培养,筛选出相对抑制效果在3.00以上的拮抗菌:CF1有3株,CF2有8株,CF3有4株。菌株Bipolaris sorokiniana在拮抗培养中,自身的生长速率被促进,说明其拮抗效果明显。在所选用的15种杀菌剂中,10种杀菌剂对3株富士长喙壳生长抑制率大于50%,3个菌株抗药性的强弱能力为:CF3>CF2>CF1。     

马铃薯炭疽病菌分离与鉴定

[目的]对进境船舶上携带的带病马铃薯薯块进行了病原真菌的分离鉴定,明确其检疫重要性,并对病菌的快速鉴定方法进行研究。[方法]通过形态学观察和ITS序列分析对病菌进行了鉴定,并对已有的巢式PCR方法进行了验证。[结果]形态学观察和ITS序列分析表明,病原菌为球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。巢式PCR中用特异性引物Cc1NF1/Cc2NR1扩增C.coccodes得到了349bp特异性条带。[结论]巢式PCR方法可以用来对C.coccodes进行快速鉴定,该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌,在国内口岸属首次截获。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

云杉叶疫病根球壳孢菌的分子检测

从四川二郎山人工云杉林分离得到云杉叶疫病病原菌,采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增得到的序列与NCBI中的根球壳孢菌(Rhizosphaera kalkhoffi)相似度达99%。比较分析了NCBI及四川二郎山分离到的根球壳孢菌ITS区序列,采用软件primer5.0设计20个引物。通过对32株菌株DNA进行PCR扩增及产物测序,筛选得到3个特异性引物对ZYZ6、ZYZ7、ZYZ8。改变DNA模板浓度进行扩增检测,在25μL PCR反应体系中,引物对ZYZ6F/ZYZ6R检测灵敏度最高,可达到0.1 pg/μL。利用ZYZ6F/ZYZ6R对四川二郎山人工云杉针叶DNA进行检测,扩增得到310 bp左右的条带,测序结果与Gen Bank中根球壳孢菌相似度达99%。     

落叶松八齿小蠹伴生真菌富士长喙壳的致病性研究

研究人工接种条件下落叶松八齿小蠹伴生真菌富士长喙壳(Ceratocystis fujiensis)的3个菌株对长白落叶松样树和木段的致病性,结果表明,致病力最强的菌株为CF3,CF1、CF2致病力差异不大。固体接种韧皮部坏死反应区域稍大于液体接种,说明菌丝体容易在木质部与韧皮部间定殖,树体内营养条件适合伴生真菌生长。3个菌株对木段造成的伤害显著高于对样树造成的伤害,说明在伴生真菌入侵的同时样树产生了积极的防御反应。在接种样树和木段产生的坏死反应及蓝变区域内均可以分离到接种真菌。     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

山东省主产烟区烟草炭疽病菌的鉴定与分子检测

从山东临沂等地采集烟草炭疽病害标本,并进行分离、检测、鉴定。结果表明,山东烟草炭疽病原为毁灭炭疽菌。根据烟草炭疽菌与其它烟草病害病原菌核糖体转录间隔区(internal transcribed spacerI,TS)序列间的差异,设计了一对特异性引物Co1/Co2。利用此引物可从烟草炭疽菌总DNA中扩增约300 bp的特异性片段,其余菌株和对照PCR结果为阴性。灵敏度实验证明,可以检测到目的片段的DNA浓度为0.1 pg/μl。对土样检测结果表明,该引物能特异性地检测到Colletotrichum destructivum的存在,为快速、灵敏地检测烟草炭疽菌提供了应用依据。     

柑桔炭疽菌果胶裂解酶pelB基因特异性引物的筛选

以柑桔炭疽菌为主要研究对象,根据已知的炭疽菌果胶裂解酶pelB基因序列,运用GenBank及Primer Premier 5共设计6对引物,其中编号为PB1/PB2、Cg1A/Cg1b及Cg2a/Cg2b的引物可扩增出pelB基因片段,经同源性分析,全序列与GenBank中登录号为GU478342.1 pelB基因的的同源性高达98%,PB1/PB2、Cg1A/Cg1b对柑桔胶孢炭疽菌果胶裂解酶pelB基因有较高特异性。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。     

巴西橡胶树HbICE2基因的克隆及表达分析

ICE(inducer of CBF expression)介导的非依赖ABA信号传导途径在植物应对低温胁迫反应中起重要的调节作用。采用RT-PCR技术从橡胶树无性系热研8-79的叶片中扩增到1条全长c DNA,共1 677 bp,包括1 593 bp的开放阅读框,编码530个氨基酸,含有bHLH结构域,其中包含19个特征性的保守KMDRASILGDAI(D/E)YLKELL氨基酸序列,命名为HbICE2(Gene Bank登陆号:KY406163)。该基因编码的蛋白分子质量为58.02 KDa,理论等电点为5.95。荧光定量PCR分析结果表明,HbICE2主要在叶片和树皮中表达,而且在原生皮中的表达量显著高于再生皮,在抗寒性较强的橡胶树无性系PR107的树皮中表达量显著高于抗寒性弱的橡胶树无性系热研8-79。HbICE2可能在橡胶树树皮应对低温胁迫的反应中起重要的调节作用。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

刺盘孢属真菌PCR检测方法的建立

【目的】刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是重要的植物病原菌,引起植物炭疽病。建立刺盘孢属真菌PCR检测方法。【方法】比对分析刺盘孢属及其近似属的ITS序列,设计刺盘孢属特异性引物,建立PCR扩增体系,验证引物的特异性和灵敏度。【结果】设计出刺盘孢属特异性引物ITS-c3/c4,建立了刺盘孢属常规PCR检测体系。建立的PCR体系能从刺盘孢属菌株中扩增出449 bp的特异性条带,刺盘孢属的近似属菌株未能扩增到条带。灵敏度试验可检测到DNA的浓度为2.2 pg/µL。【结论】用建立的PCR体系对炭疽病梨果实样品进行检测,可从发病组织中检测到刺盘孢属真菌。建立的PCR方法可靠、灵敏度高,能够快速、准确检测出刺盘孢属真菌。