斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

苦蘵P450家族基因鉴定与表达分析

细胞色素P450酶(cytochrome P450)广泛参与植物次生代谢,是当前的研究热点。基于苦蘵转录组数据,分析并鉴定了部分苦蘵P450家族基因。共鉴定得到795个可能为P450家族基因的序列片段,并将它们聚类到25个不同的聚类(cluster)中,其中,有12个聚类具有组织特异性表达。最终拼接得到30个苦蘵P450家族基因的全长序列,它们与其他物种P450基因高度同源。进化分析表明,这30个苦蘵P450基因可归为9个P450亚家族。通过定量PCR技术,分析了多个P450基因在果实不同成熟阶段的表达变化。结果表明,9个P450基因随着果实成熟表达量上升,另外9个P450基因表达量则逐渐降低。以果实为材料,分析了P450家族基因在乙烯(ACC)与乙烯抑制剂(1-甲基环丙烯,1-MCP)处理下的表达变化。研究表明,部分P450家族基因在ACC和1-MCP处理下表现出相反的表达模式,这说明P450可能参与乙烯介导的果实成熟过程。克隆了3个果实特异表达的P450家族基因(comp164210、comp131532、comp152181),它们主要定位于细胞质和细胞膜中。本研究为苦蘵药用性状遗传改良提供了有价值的遗传信息。     

稻纵卷叶螟P450基因CYP6K1的克隆与序列分析

为探讨稻纵卷叶螟产生抗药性的机制,防止或延缓稻纵卷叶螟抗药性的产生,从稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)4龄幼虫中肠提取总RNA,用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增稻纵卷叶螟P450基因CYP6K1,将其克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明,该基因的cDNA片段长度为1...     

金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因的克隆及表达

【目的】克隆并鉴定金纹细蛾(Phyllonorycter ringoniella)细胞色素CYP6家族基因,并观察氯氟氰菊酯药剂处理后mRNA相对表达量的变化,为金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因全长cDNA的获得,以及防止或延缓金纹细蛾抗药性的产生提供理论依据。【方法】以GenBank上公布的CYP6家族基因编码区序列为基础设计并合成简并引物;利用RT-PCR扩增获得序列后在NCBI上进行Blastx对比,根据P450基因命名法进行命名并向GenBank提交序列获得登录号;利用点滴法和qRT-PCR技术,将金纹细蛾3龄幼虫在氯氟氰菊酯(LC50=12.88mg/L)条件下处理24h后,观察其体内细胞色素P450基因的相对表达量。【结果】成功扩增出3个长度分别为415,412和421bp的cDNA片段。同源性分析表明,3条基因序列与CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab氨基酸相似性分别达61%,59%和71%,可将其初步均归类为CYP6家族,并分别命名为phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab,将序列信息提交至GenBank,获得GenBank登录号分别为KJ559411、KJ559412和KJ559413。药剂处理对3种基因发生了不同的诱导或抑制作用,phCYP6AN5基因在受到药剂处理后相对表达量显著上升,而phCYP6B5和phCYP6ab在受到药剂处理后相对表达量显著下降。【结论】成功获得3条金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因片段;诱导剂的诱导作用存在一定程度的特异性,对某种或几种P450酶有效应的化合物并不一定诱导其他类型的P450。     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据, 通过BLASTP比对, 选择了主要与抗性相关的CYP3集团(clan)中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象, 用RT-PCR方法对其进行了克隆. 结果表明, 该基因ORF为1 467 bp, 编码489个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa, 等电点为8.64. 只有1个内含子, 外显子/内含子边界处符合GT-AG规则. 与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性(identity)相对较高, 分别为34%、 32%, 低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定, 从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1(GenBank 登陆号: EF415297).     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

飞蝗3个细胞色素P450基因的分子特性及功能

【目的】研究飞蝗（Locusta migratoria）细胞色素P450（CYP450）第四家族（CYP4）中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1（GenBank登录号： KF857162、KF857163和KF857164）。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力,通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30,同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp,编码506个氨基酸;CYP4C73开放阅读框1 521 bp,编码 507个氨基酸;CYP4DH1开放阅读框1 512 bp,编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析,发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高;不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰,发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量,分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,这些基因均可被双链RNA干扰而沉默,但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后,飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。     

白背飞虱细胞色素P450还原酶基因的分子特征与表达模式分析

从水稻重要害虫白背飞虱(Sogatella furcifera)中克隆了一条编码细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase,CPR)的全长cDNA,命名为SfCPR,其开放阅读框全长为2 034bp,编码一个含有677个氨基酸残基的蛋白质.SfCPR蛋白质的2级结构具有CPR的典型特征,例如N端跨膜区、黄素单核苷酸结合域、黄素腺嘌呤二核苷酸结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合域,以及保守的催化残基.系统进化分析结果显示,SfCPR与灰飞虱和褐飞虱的CPRs聚在同一分支.荧光定量聚合酶链式反应结果显示:SfCPR基因在白背飞虱各龄期均有表达,其中以成虫表达量最高;在白背飞虱成虫各组织中均能够检测到SfCPR基因的表达,其中,以腹部表达量最高.使用亚致死剂量的溴氰菊酯、吡虫啉和噻嗪酮处理白背飞虱3龄若虫后,试虫的SfCPR表达水平均显著上升.上述结果为进一步研究该基因的生理功能奠定了基础.     

菊科植物青蒿细胞色素P450基因家族分析

菊科植物青蒿由于体内含有青蒿素-目前世界公认的抗疟疾首选药物,而倍受科学家的关注.本研究从NCBI中下载到青蒿P450全部全长序列,经过一致性鉴定,共获得41个P450单加氧酶基因.根据P450标准命名规则,这41个基因分布在3个基因簇的11个家族中.与水稻、拟南芥P450比对发现,拟南芥中所特有的CYP82、CYP83和CYP716中有3个家族在青蒿中出现,而水稻特有的CYP92家族在双子叶植物青蒿中也存在.对青蒿P450蛋白的理化性质和结构特性进行了分析,次级结构分析表明,青蒿P450蛋白二级结构极其相似,其高级结构以α-螺旋为主.     

二化螟对杀虫单等4种杀虫剂的抗药性

以安徽太湖县敏感地区二化螟（Chilo suppressalis Wallker)自然种群为敏感种群，根据用药水平差异，有代表性地选用浙江，江苏和安徽3地区田间种群，监测了二化螟对杀虫单等4种杀虫剂的抗性水平，结果表明：（1）浙江慈溪二化螟3幼译杀虫单已产生高水平抗性（RR＝54．6），对杀螟松产生了中等水平抗性（RR＝13．9），对敌敌 氰戊菊酯仍较敏感；（2）安徽安庆二化螟3龄幼虫对杀虫单处于中抗水平（RR＝10．8），对杀螟松，敌短短 畏和氰戊菊酯仍较敏感。（3）江苏兴化二化螟3龄幼虫与安庆相似，对杀虫单中抗（RR＝12．6），对其它被试药剂仍较敏感；（4）不同地区用3龄和6龄幼虫测定的抗药性水平相近，同时用太湖敏感种群和慈溪高抗种群进行的增效试验表明，TPP 对杀虫单无增效作用，但PBO在抗性种群中对杀虫单有 一定的增效作用，说明该种群对杀蝗抗性与多功能氧化酶有一定的关系。     

浙江慈溪水稻二化螟抗药性研究初报

采用毛细管点滴法，测定了浙江慈溪水稻二化螟对4类9种杀虫剂的抗性和敏感性水平。结果表明，该地的二化螟对杀虫双、杀虫单、杀虫安、甲胺磷4种杀虫剂均已产生高水平抗性，对杀螟硫磷已产生中抗，对甲基对硫磷、三唑磷、氰戊菊酯则仍保持敏感水平，同时发现二化螟对氟虫腈极为敏感，对6龄幼虫的LD50仅0．3833μg/g。     

抗性二化螟综合治理研究初报

通过一系列田间试验 ,明确了二化螟发生与水稻播、栽期及品种间的关系 ,发现在常熟地区将水稻播、栽期分别推迟到 5月 2 0日和 6月 2 0日后 ,可以有效地减轻螟害的发生。在目前使用的和推荐使用的 10种治螟药剂中 ,防治抗性二化螟的单剂以三唑磷、乐斯本和锐劲特防效 (>85 % )较好 ,复配剂以三唑磷与其它有机磷或阿维菌素的复配制剂防效为最好 ,防效均在 90 %以上 ,其中稻虫胺 ,克螟劲的防效达 10 0 %。频振诱杀灯对二化螟成虫也有一定的诱杀作用。在此基础上 ,制定并验证了一套治理抗性二化螟的综防技术     

二化螟对三唑磷的抗性发生动态与风险评估

对浙江省苍南县稻田第一代二化螟的抗药性进行了3年的监测。结果表明：二化螟对三唑磷、灭多威和阿维菌素的抗药性上升迅速,尤其是对三唑磷的抗性达到极高抗水平（2367．3）;对水胺硫磷与甲胺磷抗性变化不大;而对氟虫腈的抗性则有所下降。在室内用三唑磷对采自浙江省苍南县的二化螟进行连续14代筛选,结果抗性由203．3倍上升到3272．6倍,室内三唑磷筛选抗性的现实遗传力（h^2）为0．3105,表现出较大的抗性风险。生物适合度的实验表明,抗性品系、田间抗性种群的生物适合度均低于敏感品系。在抗性筛选过程中,当抗性达到1523．7倍（第9代）时,停止筛选,5代后抗性水平下降到327．1倍并保持相对稳定;恢复筛选后,抗性水平又上升。表明二化螟对三唑磷的抗性应采取早期治理。     

二化螟抗药性监测方法及相对敏感基线

选用安徽太湖县二化螟 (ChilosuppressalisWalker)自然种群 ,用 6种药剂对 6龄幼虫进行毒力测定 ,并与国内外已知敏感品系的LD50 值比较 ,在证实了该种群具有较高的敏感水平后 ,经室内纯化和连续饲养近 2 0代 ,育成相对敏感品系(TH S)。为提高试验准确性 ,简化操作 ,使用 4龄幼虫进行抗药性研究。用于测试的 4龄幼虫形态特征为头宽 (0 86±0 0 4)mm ,体重 (8 5± 1 5 )mg ,前胸与头宽之比 1 19± 0 0 4,体长 (10 0± 0 8)mm。在详细观察 4龄幼虫发育历期和形态特征后 ,选用该龄幼虫 ,建立了包括沙蚕毒素、有机磷、杂环类和生物制剂等类的 6种杀虫剂的相对敏感基线。     

氟虫腈对二化螟抗、感种群的亚致死效应

用氟虫腈亚致死剂量分别处理浙江苍南县抗性二化螟和安徽太湖县敏感性二化螟。结果表明，处理后两种群的存活率、产卵量、孵化率都明显降低，幼虫期延长；氟虫腈对抗性种群存活率的持续影响作用大于对敏感种群的。此外，亚致死剂量处理后，敏感种群的酯酶(CarE)活性比对照明显升高，敏感、抗性种群的Km值均增大，表明酯酶对底物的亲和力都有所降低。     

二化螟幼虫抗药性相关酶系的组织及亚细胞分布特征

研究了二化螟幼虫体内抗药性相关酶系的组织及亚细胞分布特征。结果表明,二化螟幼虫体内的解毒酶均以脂肪体和消化道组织中的活性较高,而血淋巴中的活性明显较低;乙酰胆脂酶在各组织中均检测到酶活性,其中以消化道的比活力最高,而脂肪体、体壁和血淋巴中的比活力相当;从亚细胞分布来看,MFOs和AChE主要分布在细胞核和细胞碎片、线粒体和微粒体等有膜的亚细胞结构中,而胞质溶液的活性明显较低;GSTs和Care均以胞质溶液中的比活力最高,其次为线粒体、细胞核和碎片,微粒体的比活力最低。     

黑龙江省二化螟虫口密度与粳稻产量损失关系及经济阈值的研究

文章研究了黑龙江省水稻二化螟虫口密度与水稻产量损失的关系和经济阈值,为指导黑龙江省水稻生产,防治二化螟提供了理论依据。结果表明,在水稻分蘖期,二化螟虫口密度(X)与产量损失率(Y)的回归方程为:Y=2.0536X-4.2161,R2=0.9756;枯心率(X)与产量损失率(Y)的回归方程为:Y=1.7187X-2.7756,R2=0.9704。在水稻孕穗期,虫口密度(X)与产量损失率(Y)的回归方程为:Y=1.1971X-0.5521,R2=0.9646;白穗率(X)与产量损失率(Y)的回归方程为:Y=1.5032X-1.9087,R2=0.9806。在水稻分蘖期,其经济阈值为每100丛水稻有二化螟幼虫90~116头;在水稻孕穗期,其经济阈值为每100丛水稻有二化螟幼虫60~103头。