CD163双等位基因编辑猪的制备及传代

【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F₁代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F₁代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA (sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA (sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。     

CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

【目的】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。【方法】用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型...     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

一种准确、简便测定CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来发展迅速的一项基因定点编辑技术,但对特定CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率进行有效评估的方法仍十分匮乏,本研究的目的是建立一种准确、简便测定CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法。在我们的方法中,将与种子专一表达启动子(2S3)连接的mCherry荧光蛋白报告基因作为选择基因,并以编码脂肪酸脱氢酶FAD2的基因为靶序列;然后对经CRISPR/Cas9编辑的拟南芥种子进行脂肪酸组分分析,根据其组分变化计算该方法的编辑效率。结果显示,利用mCherry荧光蛋白报告基因的种子专一表达特性,可简便快速地筛选阳性的初级转化子和后代的无转基因突变子;而种子油脂分析法能快速、准确地鉴定CRISPR/Cas9编辑的突变体,可以精确地检测出核酸长度小至单个碱基对的突变,用该方法获得的CRISPR/Cas9基因编辑效率(54.5%～74.1%)远高于基于聚丙烯酰氨凝胶电泳法获得的编辑效率(3.7%～15.4%)。说明,该方法检测CRISPR/Cas9基因编辑效率的高效性与可行性。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因定点突变细胞株

肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失; qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比, 2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用奠定了基础。     

通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪

目的建立快速筛选猪的基因编辑阳性成纤维细胞系的方法以提高利用体细胞核移植产生基因编辑克隆猪的效率。方法通过PCR、T7EN1酶切和Sanger测序分析不同数量的已知猪基因编辑阳性细胞(20、50、100、150和200个细胞)的基因型,确定最小细胞数用于鉴定未知的基因编辑阳性细胞系以证明该方法的可行性。结果除20细胞组外,其他所有细胞组中均扩增出2条明显的T7EN1酶切条带(175和555 bp)。定量数据显示：20细胞组和50细胞组之间的条带灰度值存在极显著差异(P<0.01),因此50细胞可用于基因编辑阳性细胞系鉴定。利用CRISPR/Cas9系统构建IPO13打靶载体,转染猪胎儿成纤维细胞形成细胞克隆点后计数50个细胞来筛选阳性细胞系,再通过体细胞核移植快速生产了IPO13敲除猪,从而证实通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪的可行性。筛选基因编辑阳性细胞系的一般方法大约需要33.7 d,新建立的方法细胞筛选周期仅为18.9 d (减少15 d),获得阳性细胞系的成功率也提高了约4倍。结论本研究建立了一种通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑克隆猪的方法,该方法可行可靠。     

甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族，分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体，为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因，分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物，以载体pHSN401为模板，扩增获得sgRNA克隆框，使用Bsa I酶切pHSN401载体，利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌，挑选单克隆进行培养，随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501～605 aa不等，平均分子量约为59 351 Da,等电点为5.04～6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在AMS基因的CDS区设计3个靶位点，分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建...     

猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。     

稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立

以RT-PCR方法从原代猪肺泡巨噬细胞中获得CD163 cDNA序列,然后测序鉴定,对突变碱基进行修正,将修正后碱基序列克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,构建重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163,通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。使用脂质体2000将pcDNA4.0-CD163转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),通过Zeocin抗性筛选,建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系。RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)检测结果表明CD163在mRNA和蛋白质水平均已表达。通过Zeocin抗性筛选,共获得8株表达CD163的重组细胞株,IFA检测结果表明表达的CD163定位于重组细胞的细胞膜表面。去除筛选抗性后连续传代10代,间接免疫荧光检测结果确定重组细胞株在10代内性状稳定,说明稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系构建成功。     

CRISPR/Cas9技术介导猪基因组单碱基编辑效率的研究

利用国际上最新的两种基于CRISPR/Cas9的BE3(Cytosine base editor,CBE)和ABE7.10(Adenine base editor,ABE)单碱基修饰技术对猪基因组靶基因位点进行编辑效率的分析研究。设计、合成并构建4个猪基因组靶基因位点gRNA表达载体,分别与CBE或ABE共转染PK15细胞,继续培养48 h,结合二代测序技术测定单碱基替换效率和indels发生率。结果表明,单碱基编辑系统BE3和ABE7.10对猪基因组靶位点碱基修饰的活性编辑窗口主要分别为5个核苷酸和4个核苷酸;两套单碱基编辑系统主要对编辑窗口内的目标碱基进行单碱基转换而非indel;两套单碱基编辑系统对猪基因组碱基置换有一定偏好性,其中CMAH、MC1R(1-2)、MC1R(2-1)基因编辑窗口内C→T的效率分别为2.2%、0.4%和1.3%;猪GGTA、MSTN-2窗口内A→G的效率分别为1.4%、1.4%。表明单碱基编辑系统BE3和ABE7.10均能够对猪细胞的基因组靶位点序列进行有效的单碱基置换。     

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

靶向加工番茄elF4E1的CRISPR/Cas9载体有效性验证

【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。     

慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB（bone morphogenetic protein receptor, type IB）基因的猪胎儿成纤维细胞（pig fetal fibroblasts, PFF）,并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sgRNAs（single-guide RNAs）序列;得分最高的sgRNA与互补序列（包含接头）退火成双链后连接入线性化的lentiCRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45 μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为6 μg·mL^-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5 μg·mL^-1嘌呤霉素的培养液中筛选6-7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑（打靶）细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%（2/20）的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降（P < 0.01）。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞（P < 0.01）;打靶细胞中,随着传代的（P5、P7和P9）增加其增殖能力极显著下降（P < 0.01）,而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异（P > 0.05）;打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。