褪黑素受体Mel 1a在皖西白鹅各组织中的表达与分布

【目的】探究褪黑素受体Mel 1a在皖西白鹅各组织中的分布特点和表达水平,为褪黑素在皖西白鹅的功能调控奠定理论基础。【方法】以皖西白鹅作为研究对象,提取各组织器官的总RNA,采用Real-time PCR和Western blot检测褪黑素受体Mel 1a mRNA和蛋白在鹅组织中的分布和差异性表达,免疫组化检测褪黑素受体Mel 1a蛋白在鹅的组织中的表达。【结果】在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、大脑、小脑、肌肉、卵巢各组织中均存在Mel 1a mRNA表达;Mel 1a蛋白广泛分布于大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏、胰脏和肌肉组织细胞中,利用Image-pro plus 6软件分析免疫组化阳性信号的IOD值显示,脾脏阳性信号最强,其次是胰腺。脾脏显著强于大脑,肺脏中的信号显著强于心脏和肌肉组织。采用Real time PCR和Western blot技术检测各组织中Mel 1a mRNA和蛋白表达水平,结果表明,卵巢中表达水平最高,其次是胰腺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏和脑组织中,肺脏和肌肉中的表达水平最低,另外在各级卵泡中Mel 1a mRNA的表达水平随卵泡发育逐渐增加,直到...     

鹅Mel 1c基因的克隆及生物信息学分析

从鹅脑组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增Mel 1c基因c DNA序列。结果表明,Mel 1c基因序列长为1 118 bp;与已报道其他物种的Mel 1c同源性为58.4%~72.2%;氨基酸序列的同源性为74.7%~97.0%;该基因编码的蛋白质为N端在胞内的六次跨膜蛋白,含有信号肽的分泌蛋白,N端亦含有两个糖基化位点;该蛋白也含有G蛋白偶联受体家族的结构域。     

褪黑素受体Mel 1b基因mRNA和蛋白在鸭不同组织中的表达与分布

褪黑素广泛的生理作用是通过与其膜受体(Mel 1a、Mel 1b、Mel 1c)结合介导的。褪黑素受体在机体内广泛分布,但因受体亚型、物种、组织不同而异。采用RT-PCR、real-time PCR和免疫组化技术探究了Mel 1b在鸭不同组织(包括鸭脾脏、心脏、肾脏、大脑、胸肌、卵巢、肺脏、肝脏、胰脏组织)中的表达分布及相对表达量。结果表明,鸭Mel 1b mRNA在脾脏、心脏、肾脏、大脑、胸肌、卵巢、肺脏、肝脏、胰脏中均有表达,且Mel 1b受体蛋白均存在于大脑、肺脏、肝脏、胸肌、肾脏、心脏、胰脏中(脾脏、卵巢未成功测试)。Real-time PCR结果表明,各组织中Mel 1b mRNA表达量存在差异,在卵巢中的表达量最高,其次为肺脏,在脾脏、心脏、肾脏和肝脏中的表达量也明显高于大脑中的表达,但在胸肌和胰脏中的表达量要稍低于大脑中的表达量。Mel 1b在鸭各组织中普遍表达分布,进一步说明了其介导褪黑素广泛的生理功能,特别是对生殖功能的调节。     

褪黑素受体Mel1a在鸭不同组织中的表达研究

褪黑素是由松果体分泌的吲哚类激素,褪黑素通过与其受体（Mel 1a, Mel 1b and Mel 1c）结合发挥对动物的节律性,生殖调控,抗凋亡和抗氧化等调节作用。为探究Mel1a mRNA和Mel1a蛋白在鸭不同组织中的表达与分布以及在各个组织的相对表达量,研究褪黑素通过Mel1a受体参与鸭的生殖调控作用及其他生物学效应奠定基础,采集鸭心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、胰和骨骼肌肉组织,利用PCR、免疫组织化学和RT PCR技术研究Mel1a mRNA和Mel1a蛋白在鸭各组织中表达分布以及Mel1a mRNA的相对表达量。研究结果表明：鸭Mel1a mRNA在心、脾、大脑、小脑、肾、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌组织中均存在表达;Mel1a蛋白在大脑、肺、肝、骨骼肌、肾、心和胰组织中均有表达;Mel1a mRNA定量结果表明,各组织中的Mel1a mRNA表达量存在差异,大脑、肺、卵巢、脾、小脑和胰脏的相对表达量较高,而肝、骨骼肌、肾和心的相对表达量较低。褪黑素首先通过与其受体结合而发挥生理调控功能,所以通过研究Mel1a mRNA和蛋白在不同组织的表达分布及其相对表达量,为研究褪黑素及其受体的生理功能如调控昼夜节律,抗凋亡、抗氧化、增强免疫力、卵母细胞成熟以及胚胎的发育探究提供基础。     

鹅催乳素受体多克隆抗体制备及组织表达分析

为深入研究鹅催乳素受体(PRLR)的功能,构建了含鹅PRLR胞外域编码序列exPRLR的原核表达质粒exPRLR-pET-28a(+),通过转化E coli Roster建立了稳定的原核表达系统,在IPTG诱导下获得了PRLR胞外域的重组exPRLR.以重组exPRLR为抗原免疫家兔,获得了兔抗鹅exPRLR的抗血清.Western blot分析证明该抗血清可特异识别由原核生物表达的重组exPRLR.进一步分析成年母鹅的组织蛋白,发现成年鹅中可能至少存在3种相对分子质量不同的PRLR蛋白异形体.     

鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达

构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

褪黑素和烟酰胺单核苷酸对鹅骨骼肌卫星细胞增殖的影响

【背景】目前关于褪黑素（melatonin,MLT）的研究多集中在家禽的生殖功能上,而与家禽肌肉发育相关的作用机制却鲜有研究。同时MLT与烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)功能相似且都与昼夜节律相关,研究发现MLT与NMN的单一处理对细胞衰老的影响有限,而共同处理的效果更为显著,虽然二者对线粒体功能和骨骼肌衰老的影响也有相关报道,但在骨骼肌生长发育的作用机制方面尚无可以参考的报道。【目的】通过探究MLT与NMN参与浙东白鹅骨骼肌卫星细胞增殖的分子机制,为其在家禽生产实践中的应用提供思路。【方法】通过解剖鹅胚分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并对骨骼肌卫星细胞的特异性蛋白Pax7和Desmin进行免疫荧光染色以此鉴定细胞,在体外成熟培养基础上用1 ng·mL-1 MLT与1μg·mL-1 NMN分别单独或组合处理细胞24 h后,利用CCK-8检测细胞活力;为探究MLT如何调控鹅骨骼肌卫星细胞增殖的机制,通过构建MLT受体基因（MTNR1A、MTNR1B）的过表达载体,并与1 ng·mL-1 MLT共同处理细胞,采用qRT-PCR和Western b...     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。     

ITGB1基因表达与鹅肥肝形成的关系

为探究ITGB1基因与鹅肥肝形成的关系,选取30只70日龄健康朗德公鹅,随机分为填饲组与对照组并进行24 d填饲.运用ITGB1基因序列进行生物信息学分析,采用RT-qPCR技术检测不同填饲阶段(填饲12d与24d)鹅肝脏中ITGB1基因的表达水平,同时,使用不同剂量的脂肪肝形成相关因子(胰岛素、葡萄糖、油酸、亚油酸和棕榈酸)处理鹅原代肝细胞,检测ITGB1基因的表达水平.结果 发现:全长CDS共2418 bp,编码805个氨基酸,与鸭的同源性高于98％,可编码1种亲水性蛋白;与对照相比,填饲12d与24 d时,鹅肝脏中ITGB1基因的表达均显著上调(P＜0.05);0.5 mmol·L-1油酸、亚油酸和棕榈酸均能显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.05);200mmol·L-1葡萄糖能极显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.01);此外,0.2 mmol·L-1胰岛素也能在一定程度上有诱导其表达上调的趋势(P=0.098).结果 表明,ITGB1基因表达上调与鹅肥肝形成密切相关,受脂肪肝形成相关因子诱导,提示ITGB1基因表达上调可能会促进鹅肥肝的形成.     

鹅皮肤BMP4基因mRNA表达研究

采用荧光定量PCR方法研究BMP4基因mRNA在吉林白鹅胚胎期和生后期皮肤中表达变化规律,并采集21~29胚龄胎毛及40~130日龄鹅背部羽毛,观察羽毛生长发育规律及羽毛分支。结果表明:BMP4基因mRNA在鹅皮肤毛囊发育的整个过程中都有表达,胚胎期21~29胚龄表达量相对较低,40~70日龄时,鹅背部皮肤中BMP4mRNA表达量呈线性快速增加,在70日龄时BMP4mRNA相对表达量为2.575,是40日龄时相对表达量0.931的2.77倍,70~90日龄BMP4mRNA表达量有所下降,90~130日龄表达量呈线性快速增加,BMP4相对表达量在130日龄时达到了4.943,是40日龄时的5.31倍,是90日龄时相对表达量1.814的2.73倍。羽毛的长和直径以及羽小枝长和直径增长速度在90日龄后减慢,呈平稳增长状态。可见,BMP4基因在鹅羽毛快速发育时期低表达,在羽毛发育速度较慢的时期高表达,且在片羽分支阶段高表达,可能与羽毛分支有一定关系。     

鹅副粘病毒M基因主要抗原位点片段的原核表达及鉴定

根据GenBank中发表的GPMV SF02株M基因核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/G0株M基因主要抗原位点片段M1,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明,所扩增的M1基因核苷酸长为444 bp,共编码148个氨基酸.将M1同载体PGEX-6P-1连接后,转化入E.coli BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达出目标蛋白,与预计相符.对表达的M1蛋白进行Western blot鉴定,表明所表达的M1蛋白可以与GPMV SF02株阳性血清发生特异性反应.     

Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生长轴中的表达

【目的】探讨Nesfatin-1在大鼠生长轴(下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、肌肉)中的定位及其mRNA的表达情况。【方法】对雌性大鼠进行深度麻醉灌注后,采集下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织,放入4%多聚甲醛溶液中固定,采用免疫组化PV-9000二步法、DAB显色技术检测Nesfatin-1在生长轴上的分布,另取雌性大鼠断头处死,取相同组织用荧光定量PCR方法检测其中Nesfatin-1mRNA的表达情况。【结果】Nesfatin-1主要分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、室周核、外侧区、弓状核、视上核、腺垂体、胰腺的胰岛和腺泡及肝脏与肌肉中。平均光密度分析显示,Nesfatin-1在室周核和胰岛的表达量显著地高于其他组织(P0.05),在胰腺腺泡、肝脏及肌肉中的表达量则显著地低于其他组织(P0.05),在下丘脑背内侧核、外侧区和室旁核中的表达量显著高于视上核、弓状核和腺垂体(P0.05)。Nesfatin-1mRNA在胰腺中表达量最高,腺垂体次之,下丘脑和肝脏较低,在胰腺和腺垂体的表达量显著高于下丘脑和肝脏,但下丘脑与肝脏差异不显著(P0.05);在腓肠肌中未检测出Nesfatin-1mRNA的表达。【结论】Nesfatin-1及其mRNA在生长轴中的广泛表达,表明Nesfatin-1可能对大鼠生长发育具有调控作用。