脑源性神经营养因子抑制牛卵泡颗粒细胞凋亡

为研究脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响。首先利用CCK8检测了不同浓度(0,10,50,100,200 ng/m L)的BDNF处理牛卵泡颗粒细胞24 h之后细胞活性变化情况,发现50,100,200 ng/m L的BDNF都能够极显著的增加颗粒细胞的活性(P0. 01)。以100 ng/m L作为BDNF最适处理浓度,利用流式细胞仪,通过线粒体膜电位检测(JC-1)发现,BDNF组的红绿荧光相对比例极显著的升高(P0. 01)。接着利用实时荧光定量PCR方法,发现BDNF导致P53、Bax和Caspase-3的mRNA表达水平极显著降低(P0. 01),而Bcl-2无显著变化(P0. 05)。最后通过siRNA干扰内源性的BDNF的合成(P0. 01),利用实时荧光定量PCR方法发现,干扰BDNF之后,P53极显著的升高(P0. 01),Bax显著升高(P0. 05),Bcl-2和Caspase-3无显著差异(P0. 05)。结果表明:BDNF对牛卵泡颗粒细胞的凋亡有抑制作用,为牛卵泡的发育和颗粒细胞功能的研究提供了新的途径。     

WNT6基因对蛋鸡卵泡颗粒细胞的影响及机制研究

[目的]本文旨在研究WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能及其作用机制。[方法]以300日龄海兰蛋鸡为研究对象，检测WNT6 mRNA在不同组织中表达特征。对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，ELISA检测细胞培养基中的孕酮(P4)含量，荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体(FSHR)和StAR、CYP11A1等基因表达水平。设立卵泡刺激素(FSH)浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6及WNT通路相关基因表达水平的影响。[结果]WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖(P<0.01),极显著提高颗粒细胞P4合成量(P<0.01),并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达水平(P<0.05);相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制(P<0.01),P4合成量极显著显著减少(P<0.01),并显著降低FSHR、CYP11A1...     

绵羊卵泡颗粒细胞体外培养条件的优化

为了探讨绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养时FSH(Invitrogen)与胰岛素的最佳质量浓度,试验在无血清条件下培养绵羊卵泡颗粒细胞,并向其中加入不同质量浓度的FSH与胰岛素,体外培养7 d后测定细胞数目以及培养液内雌二醇浓度。结果表明,当培养液内FSH质量浓度为25 ng/mL、胰岛素质量浓度为100ng/mL时,颗粒细胞的数目最多;当FSH质量浓度为1 ng/mL、胰岛素质量浓度为10 ng/mL时,培养液内雌激素质量浓度最高。     

不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响

为确定不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响,探讨最佳培养体系,比较了M199培养液中3种FSH浓度(0.5、1、2IU/mL)对腔前卵泡体外培养的影响。结果表明:FSH浓度为2IU/mL时腔前卵泡的生长率最高,2 IU/mLFSH与0.5IU/mLFSH相比,在卵泡生长率、成腔率和存活率上都存在着显著差异(P<0.05)。3个处理组腔前卵泡前5d生长率与后5d相比差异极显著(P<0.01)。结论:高浓度的FSH能显著地促进腔前卵泡的生长和腔的形成,且能够提高腔前卵泡的成活率。猪腔前卵泡体外培养呈前高后低的生长模式。     

FSH处理对猪颗粒细胞中类固醇合成酶基因的表达及其调控区组蛋白H3修饰的影响

【目的】研究FSH处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇合成酶、垂体激素受体、凋亡相关等基因表达的影响及此过程中组蛋白H3修饰的变化情况。【方法】首先,采集猪卵巢组织并用注射器抽取方法收集卵泡颗粒细胞,用含血清体系体外培养颗粒细胞至贴壁,血清饥饿16h后用终浓度5IU·mL~(-1)的FSH处理24h,并收集细胞。其次,提取细胞m RNA,采用qRT-PCR方法检测类固醇合成酶(STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1)、垂体激素受体(FSHR和LHR)、凋亡相关基因(XIAP和Fas L)m RNA的表达变化,最后,相同处理后固定细胞,采用染色质免疫沉淀结合q PCR(Ch IP-q PCR)方法检测类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游转录调控区组蛋白H3修饰(H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac)状况。【结果】5IU·mL~(-1)的FSH处理引起类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分别为2倍(P0.01)、2.8倍(P0.01)和3.6倍(P0.05)的显著上调,而CYP11A1表达水平没有显著变化;FSH处理对垂体激素受体FSHR、LHR和凋亡相关基因XIAP、Fas L影响不显著。在上调的三个类固醇合成酶基因中,HSD3B调控区组蛋白H3修饰变化最为显著,H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac结合分别有14.7倍(P0.01)、13.6倍(P0.01)、19.7(P0.01)倍和2.5倍(P0.05)的显著上调;STAR基因调控区的H3K9ac在处理后有11.1倍的显著下降(P0.05);CYP19A基因调控区的H3K4me3和H3K9ac分别有0.5倍的上调(P0.01)和10.4倍(P0.01)的下降,其余组蛋白修饰在处理前后没有显著变化。【结论】FSH处理24h对颗粒细胞类固醇合成酶基因转录有显著上调作用,对其转录过程有H3组蛋白修饰参与,组蛋白修饰模式具有基因特异性。垂体激素受体和凋亡相关基因的应答可能需要FSH和其他因素的联合作用。     

FSH通过AKT/FOXO1通路调控绵羊卵泡颗粒细胞增殖的研究

旨在研究FSH-AKT-FOXO1途径调控绵羊卵泡颗粒细胞增殖机制。利用不同浓度FSH处理绵羊颗粒细胞(GCs),采用CCK-8法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期变化,Western-Blot检测p-AKT和p-FOXO1蛋白质表达,qPCR分析PCNA、CCnd-2和Bcl-2基因表达量变化。结果表明:10ng/mL的FSH能显著提高GCs活性,抑制细胞凋亡(P0.05);AKT/FOXO信号通路的抑制剂AT7867预处理GCs后明显降低其活性(P0.05);在FSH的作用下,GCs中AKT蛋白的磷酸化水平显著升高,而FOXO1的磷酸化水平显著降低(P0.05),同时显著上调了PCNA、CCnd-2和Bcl-2的表达水平(P0.05)。本研究表明FSH通过AKT/FOXO1信号途径促进了绵羊GCs的生长、增殖。     

绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养中促卵泡素和胰岛素浓度优化研究

为了进一步探讨在无血清体外培养条件下,促卵泡素(FSH)和胰岛素对绵羊卵巢颗粒细胞的影响,以优化颗粒细胞体外培养体系。试验设计6个FSH浓度梯度和3个胰岛素浓度梯度。体外培养7d后,检测培养体系中颗粒细胞数和雌激素浓度。与对照组相比,培养液中添加FSH与胰岛素可显著提高颗粒细胞的增殖和雌激素的分泌(P<0.01);且随着FSH浓度的增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当FSH浓度为5.0μg·L-1时,雌激素分泌量最高;随着胰岛素浓度增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当胰岛素浓度为10μg·L-1时,颗粒细胞数和雌激素分泌量最高。     

滩羊卵母细胞体外成熟培养的研究（英文）

[目的]为了探讨滩羊卵母细胞体外成熟过程中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)和雌二醇(E2)的最佳添加量。[方法]试验设为5组:对照组、FSH组(10、50、100、200和300μg/ml 5个浓度梯度)、LH组(5、10、20、50和100μg/ml 5个浓度梯度)、E2组(5、10、25、50、100μg/ml 5个浓度梯度)和FSH&LH组(100μg/ml FSH+20μg/ml LH),对滩羊卵母细胞的体外成熟培养进行研究,并统计第一极体排出率。[结果]100μg/ml FSH+20μg/ml LH组是试验各组中卵母细胞成熟率最高,为64.64%,明显高于其他4组,差异显著(P<0.05);FSH组中100μg/ml优于其他四个浓度梯度和对照组,差异显著(P<0.05);LH组的20μg/ml的浓度优于其他四组和对照组,差异显著(P<0.05),E2组中50μg/ml的浓度优于其他四组和对照组,差异显著(P<0.05)。[结论]100μg/ml FSH+20μg/ml LH是滩羊卵母细胞体外成熟培养的最佳培养条件。     

一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证

目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、Western Blot、免疫荧光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分别对纯化细胞的形态、增殖能力、激素分泌相关受体(FSHR、LHCGR)和基因(CYP19A1、CYP11A1、StAR)的表达及激素分泌情况进行检测。结果发现,经纯化的细胞贴壁能力、细胞形态和增殖能力明显改善,且各激素分泌相关基因都有表达;E2分泌量明显提高,而P4分泌明显降低。研究结果表明,经FICOLL-Paque分离液纯化后的猪卵泡颗粒细胞中黄体化的颗粒细胞被大部分清除,纯化后的细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性。     

MIF在不同直径猪卵泡的表达变化规律

为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。     

绵羊腔卵泡中葡萄糖和生殖激素及其受体基因表达的相关性分析

通过分析绵羊不同直径腔卵泡中葡萄糖与生殖激素(FSH、LH和17β-E_2)含量和相关受体基因表达的相关性,阐明不同腔卵泡发育中葡萄糖和生殖激素对卵泡生殖调控的机制。根据绵羊腔卵泡不同直径划分为小卵泡组(2.0～3.4 mm)、中卵泡组(3.5～5.4 mm)和大卵泡组(5.5 mm)3组,收集其卵泡液及颗粒细胞(GCs)。采用AnnextinV-FITC测定小、中和大卵泡中GCs凋亡情况;利用放射免疫法检测小、中和大卵泡组中葡萄糖浓度及FSH、LH和17β-E_2的含量;运用qRT-PCR技术检测小、中和大卵泡GCs中FSHR、LHR和G6Pase基因的转录水平。结果显示,不同直径绵羊腔卵泡中GCs凋亡无显著差异(P0.05);随着腔卵泡直径的增大,卵泡液中葡萄糖浓度、FSH、LH和17β-E_2的含量均升高;同时,GCs上FSHR、LHR、G6Pase基因的转录水平极显著升高(P0.01)。不同直径腔卵泡中,葡萄糖浓度与FSH含量均呈显著正相关,仅在大卵泡中与LH呈显著正相关(P0.05)。另外,葡萄糖浓度与FSHR、G6Pase基因的表达量呈显著正相关,只在大卵泡中与LHR表达量呈显著正相关(P0.05)。随着绵羊腔卵泡生长,葡萄糖与生殖激素含量和相关受体基因表达量具有显著相关性,共同参与调节卵泡发育。     

促黄体素(LH)对猪卵巢颗粒细胞细胞周期及类固醇激素分泌的影响

为揭示促黄体素对猪卵巢颗粒细胞生长及类固醇分泌的影响,从当地屠宰场采集猪卵巢,选择表面直径大于6 mm的卵泡(优势卵泡)作为试验材料,将从其中获得的颗粒细胞进行体外培养,并在培养基中添加不同浓度(0 IU/ml、2 IU/ml和4 IU/ml)的促黄体素(LH),通过流式细胞仪、放射性免疫和定量PCR分别检测细胞周期的...     

FSH对体外培养猪卵巢颗粒细胞生长及增殖的影响

采集成年健康母猪的卵巢,收集卵泡颗粒细胞,在配制好的培养液中培养。颗粒细胞原代培养体系建立成功后,分别将不同质量浓度的FSH(0.1,0.5,1,5,25 ng/mL)作用于细胞,每隔48 h换1次培养液,加入新的FSH,倒置显微镜下检测细胞的生长及增殖状况。结果表明,FSH质量浓度越大,细胞生长状况越好,差异有统计学意义(P<0.05);在固定质量浓度的FSH作用下,细胞每次换液后生长状况都会变好。FSH能促进猪卵泡颗粒细胞增殖,并与作用时间长短有关。     

维生素E和谷氨酰胺对兔精液获能的影响及获能相关基因的表达

为了探讨不同质量浓度维生素E和谷氨酰胺(glutamine,Gln)对精子获能的影响,以及与获能有关的关键基因在获能后相对表达量的差异,在获能液中加入不同质量浓度的维生素E(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/m L)或Gln(0、5、10、15、20 mg/m L),并分别将其与精子悬液一同培养,以孕酮诱导顶体反应,通过涂片染色镜检得到顶体发生率;采用实时荧光定量PCR得到获能相关基因蛋白激酶A催化亚单位β(PRKACB)和ACP6(acid phosphatase 6,lysophosphatidic)在获能后的表达。结果表明,添加质量浓度为1.0 mg/m L的维生素E对精子顶体发生率的影响显著高于其他组别(P0.05);添加质量浓度为15 mg/m L的Gln,精子顶体发生率显著高于其他组别(P0.05);与空白对照组相比,维生素E最佳质量浓度处理组(1.0 mg/m L)的PRKACB和ACP6基因的相对表达量显著性降低(P0.05);Gln最佳质量浓度处理组(15 mg/m L)处理后,基因PRKACB、ACP6在获能后的相对表达量高于空白对照组,但差异不显著(P0.05)。可见,获能液中添加维生素E和Gln对兔精子获能具有一定影响。     

固醇类物质对鹅颗粒细胞胆固醇转运相关基因表达的影响

【目的】揭示胆固醇转运相关基因在鹅不同发育阶段卵泡中的表达模式及固醇类物质对颗粒细胞上述基因表达的影响。【方法】首先应用RT-qPCR技术检测SREBP-2、STADR4、STAR和CYP11A1在产蛋高峰期鹅卵巢内不同发育阶段卵泡中的mRNA表达水平;然后分离鹅F1卵泡颗粒细胞体外培养,24 h后分别添加不同浓度胆固醇、25-羟胆固醇和洛伐他汀(胆固醇合成限速酶抑制剂)处理,最后使用MTT法检测细胞活性和RT-qPCR技术检测上述基因表达量。【结果】四个基因在不同发育阶段卵泡中的表达模式相似;高浓度胆固醇显著增加细胞活性(P0.05),25-羟胆固醇和洛伐他汀则降低细胞活性。随着胆固醇浓度升高,四个基因表达量均先升高后下降;25-羟胆固醇显著抑制SREBP-2和STAR的表达(P0.05);升高洛伐他汀浓度使SREBP-2表达量先降低后升高,与其余三个基因相反。【结论】胆固醇转运和类固醇激素合成相关基因表达量受固醇种类和浓度调节,并且与卵泡类固醇激素合成密切相关,这为揭示鹅卵泡发育机制和提高产蛋量提供了理论参考。     

卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用，为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-myc mRNA和蛋白的表达；应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达；体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞，预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后，加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH处理后，小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

母猪健康和闭锁卵巢有腔卵泡的转录组测序比较分析

[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。     

FGF1对牛卵巢颗粒细胞Spry基因表达的影响

【目的】研究体外培养牛卵巢颗粒细胞中Sprouty基因(Spry)的表达,探讨成纤维细胞生长因子1(FGF1)对Spry基因表达的影响。【方法】从屠宰场收集牛卵巢,剪下直径2~5 mm的卵泡,机械破碎卵泡后收集颗粒细胞进行体外培养,在培养的第5天用FGF1和PD98059处理培养的颗粒细胞,然后用Trizol提取细胞总RNA,利用牛特异性引物进行实时定量PCR检测,用ΔΔCt方法计算Spry基因的相对表达量。【结果】牛卵巢颗粒细胞可以表达Spry基因;Spry基因的表达与FGF1呈现剂量依赖关系,Spry2和Spry4的表达量随FGF1作用时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势;FGF1信号通过RTK/ERK通道对Spry基因的表达产生刺激作用。【结论】在体外培养的牛卵巢颗粒细胞中,FGF1信号通过RTK/ERK通道刺激牛Spry基因表达。     

猪卵泡期中等卵泡发育和闭锁的相关基因表达及激素水平分析

研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。     

鸡卵泡颗粒细胞转染Bcl-2基因对IGF-1分泌的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞.采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl-2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96 h,用流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF-1的含量.结果发现,转染Bcl-2重组质粒组的Bcl-2蛋白表达量和IGF-1分泌量均多于其他各组.分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF-1分泌量减少,而F4的IGF-1分泌量基本不变.结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl-2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF-1的作用;鸡卵泡颗粒细胞IGF-1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响.