猪圆环病毒2 型疫苗研究进展

疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)的主要方式,PCV-2疫苗的研究与开发已成为国内外兽医工作者的关注热点.在国际市场上销售的商品化PCV-2疫苗主要包括亚单位疫苗、嵌合病毒疫苗和灭活疫苗,其中PCV-2灭活疫苗已在我国规模化猪场中广泛使用.综述了近年来国内外各类PCV-2疫苗研究进展及存在的问题,以期为猪圆环病毒病的防制与PCV-2新型疫苗的研发提供参考.     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因疫苗,并对其免疫效果和安全性进行研究。【方法】将PCV2ORF2基因从pMD-ORF2*质粒(包含PCV2 SCH A株ORF2基因)酶切回收,插入到真核表达载体pcD-NA-3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-ORF2,对该质粒进行酶切和PCR鉴定。将pcDNA-ORF2转染IBRS-2细胞,进行Western blotting检测。将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗,按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+),PCV2全毒和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14天和56天采血,用ELISA法检测抗体;于首免后第56天,采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)对小鼠的细胞免疫进行检测。取首免后56 d小鼠的心肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。【结果】Western blotting结果显示,pcDNA-ORF2构建成功,并在哺乳动物细胞中获得表达。pcDNA-ORF2核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。PCV2ORF2基因未整合到小鼠染色体上。【结论】pcDNA-ORF2可诱导小鼠产生免疫反应,其对小鼠是安全的。     

猪圆环病毒疫苗研制成功

中国农科院哈尔滨兽医研究所刘长明研究员主持的《猪圆环病毒2型（PCV2）灭活疫苗（LG株）》科研项目经过10年科技攻关,终获成功,疫苗免疫攻毒保护率达96％以上。该疫苗具有如下特点：一是抗原含量高;二是免疫原性强;三是安全性好;四是免疫效果好;五是抗母源抗体干扰;六是应用效果显著。     

国内首创的“猪圆环病毒疫苗”研制成功

猪圆环病毒病是继猪蓝耳病之后国际上公认的危害养猪业的重要疫病,该病以5～12周龄的猪发病率较高,临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疸和腹泻等,急性暴发猪群的死亡率可达10％。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的“猪圆环病毒2型（PCV2）灭活疫苗（LG株）”获得成功,     

猪圆环病毒2型DNA疫苗对小鼠的免疫效果

【目的】构建一种猪圆环病毒2型DNA疫苗,并对其免疫效果进行了研究。【方法】将表达猪圆环病毒2型ORF2基因的1套真核表达元件系统克隆插入到质粒载体pMD-18T,构建成pMD-18T-ORF2,转入E.coliDH5α,提取质粒,经肌肉注射途径对Balb/c小鼠分别在第1,14和28天进行免疫,用生理盐水代替pMD-18T-ORF2进行相同操作,作为对照组,通过监测免疫小鼠体液免疫和细胞免疫的状况,评估分析pMD-18T-ORF2免疫的效果。【结果】初次免疫后小鼠血清中特异性抗体水平持续升高,在第14天达到峰值,加强免疫抗体水平无显著变化;试验组脾淋巴细胞体外增值能力较对照组低(P<0.01);免疫pMD-18T-ORF2的小鼠脾脏NK细胞杀伤活性极显著高于对照组(P<0.01);试验组小鼠脾脏中Th细胞含量与对照组小鼠无显著差异(P>0.05),Tc细胞含量显著高于对照组(P<0.05),B细胞含量较对照组有所减小,但差异不显著(P>0.05)。【结论】构建的pMD-18T-ORF2对小鼠能产生相应的免疫反应,且细胞免疫的效果较体液免疫更显著,非特异性免疫亦有提高。     

猪瘟活疫苗、猪圆环病毒2型基因工程疫苗和猪肺炎支原体灭活疫苗三种疫苗联合免疫效果的评估

试验旨在评估猪瘟活疫苗、猪圆环病毒2型基因工程疫苗和猪肺炎支原体灭活疫苗三种疫苗联合免疫的效果.试验选取7日龄健康仔猪500头,分为A组(联合免疫组)和B组(单苗免疫组).A组在21日龄,每头仔猪免疫1 mL猪圆环病毒2型基因工程疫苗、2mL猪肺炎支原体灭活疫苗和1头份猪瘟活疫苗,在55日龄每头仔猪免疫1头份猪瘟活疫苗...     

转移因子对猪圆环病毒亚单位疫苗免疫效果的影响

为探寻转移因子(TF)对猪圆环病毒亚单位疫苗免疫效果的影响,将猪脾脏研磨,并反复冻融研磨液,离心获取冻融上清,用超滤法从上清液中提取转移因子。TF经理化检验合格后,以添加剂的形式与猪圆环病毒亚单位疫苗(Cap疫苗)混合,制成TF–Cap疫苗,并和未添加TF的Cap疫苗同时进行小鼠免疫试验。TF–Cap疫苗和Cap疫苗免疫的小鼠都设一免组和二免组,首次免疫后每隔10 d对实验鼠进行尾静脉采血,并用间接ELISA方法测定血清中猪圆环病毒2型(PCV2)的抗体水平。结果表明：用超滤法制得的TF,多肽含量为1.83 mg/mL;抗体检测数据显示,4个免疫组与对照组(注射生理盐水)的抗体检测值有极显著差异(P<0.01),而4个免疫组之间无显著差异(P>0.05),TF–Cap疫苗一免组的抗体水平与Cap疫苗二免组的抗体水平相当,表明在圆环病毒基因工程疫苗中添加TF可一定程度的提高免疫动物的抗体水平。     

猪圆环病毒2型与猪流行性腹泻病毒混合感染诊断与防控

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)为重要传染性病毒,在全世界各地区广泛流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2感染猪群可导致断奶仔猪出现多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征等,导致患病猪群出现免疫抑制,以PCV2与其他病原混合感染较为常见。基于此,以河南省清丰县凤翔养猪户仔猪为例,介绍猪圆环病毒2型与猪流行性腹泻病毒混合感染的诊断与防控措施。     

圆环病毒疫苗(YZ株)对育肥猪生产性能的影响

为评估圆环病毒疫苗(YZ株)对育肥猪生产性能的影响,本试验选用3种商品化疫苗,选择胎龄相近、窝产仔数相似的母猪所产仔猪,平均分成A、 B、 C、 D4组,结果表明,性价比A疫苗"YZ株"最高。进行不同种类PCV-2疫苗临床免疫效果研究对生产实践中疫苗种类的选择具有重要指导意义,此次结果为规模化猪场选择圆环病毒疫苗提供了参考依据。     

猪圆环病毒2型组织培养特性研究

将经鉴定为PCV2阳性无菌处理的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,PCV2病毒组织培养特性是添加D-氨基葡萄糖可有效地促进PCV2病毒的增殖复制,但病毒致细胞不产生病变,不能直接观察。应用PCR方法检测组织细胞培养物中的病毒增殖和增殖滴度,测定了PCV2病毒收获时间,试验表明PCV2病毒在PK15组织培养可连续传代,增殖病毒。     

仔猪圆环病毒与葡萄球菌病混合感染的诊治

无菌采集可疑病猪的肝、脾、淋巴结组织,经过PCR检测及细菌分离接种、革兰氏染色镜检等方法进行综合诊断,确诊是仔猪圆环病毒与葡萄球菌病混合感染。饲养密度过大,环境条件差,不同日龄仔猪混养或从多家猪场引种,都可能诱发本病。保持猪舍及周围环境卫生,加强饲养管理工作,合理配比饲料,提高抗病力,是预防发病的主要措施。     

PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的研究

【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV VP2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和VP2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2,表达出可溶性蛋白Cap和VP2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV VP2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV VP2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、VP2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。     

PCV2感染仔猪急性期蛋白的变化

【目的】探讨实验性感染PCV2仔猪血清中急性期蛋白浓度和肝脏急性期蛋白表达的变化,为PCV2的致病机制和诊断提供有价值的资料。【方法】19头ELISA检测PCV2抗体阴性的5周龄健康断奶仔猪,随机分为对照组和攻毒组,在攻毒后不同时间采集血液和肝脏。用ELISA方法检测血清中APPs的动态变化,荧光定量RT-PCR测定肝脏中APPsmRNA表达,同时观察肝脏的组织病理学变化。【结果】仔猪接种PCV2后,肝脏出现实质细胞变性,结缔组织增生和嗜酸性粒细胞浸润为特征的病理学损伤;血清中,猪主要急性期蛋白(Pig-MAP)在攻毒后7d达到峰值,在7和10d显著高于对照组(P0.05);血清淀粉样蛋白A(SAA)在攻毒后7d和21d显著高于对照组(P0.05);血清载脂蛋白AⅠ(Apo-AⅠ)攻毒后21d显著高于对照组(P0.05),其余时间差异均不显著;PCV2感染后21d仔猪肝脏中结合珠蛋白(HP)、C-反应蛋白(CRP)、α1-酸性糖蛋白(AGP)和SAAmRNA的表达呈现升高的趋势。【结论】PCV2感染可引起仔猪肝脏出现以实质细胞变性坏死和结缔组织增生为特征的病理学变化,血清APPs浓度和肝脏APPsmRNA表达呈现不同的变化,其中Pig-MAP可以作为病程发展的重要检测指标,对监测PCV2感染、疾病的预后起重要作用。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

PCV2和猪伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪PBMC中IL-2及IL-6 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型（PCV2）与猪伪狂犬病弱毒疫苗（PRV）体外单接种和共接种仔猪外周血单个核细胞（PB-MC）,采用real-time PCR技术定量检测接种后不同时间PBMC细胞因子IL-2和IL-6的mRNA表达水平,以分析PCV2对PRV免疫反应的影响。结果显示,PRV接种组PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达均出现显著上调（P〈0.05）,PCV2接种组IL-2与IL-6的mRNA表达在接种后的部分时间也出现显著上调,但PCV2与PRV共接种组的IL-2与IL-6的mRNA表达较PRV组均出现显著下调,表明PCV2能够抑制PRV促进猪PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达上调作用,提示PCV2可能会对PRV的免疫反应产生不利影响。     

内皮源IL-8对PCV2感染猪血管内皮细胞迁移的影响

本研究通过建立PIEC划痕创伤模型,设细胞对照组、接毒组、IL-8抗体处理细胞对照组和IL-8抗体处理接毒组,观察内皮细胞的迁移率,同时用ELISA检测细胞上清中内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和NO的含量,以探索猪圆环病毒2型(PCV2)对猪血管内皮细胞迁移方面的影响因素。结果显示,接毒组细胞迁移率、上清中bFGF、VEGF含量显著高于对照组;抗体处理细胞对照组上清中bFGF、VEGF、NO含量显著低于细胞对照组;抗体处理对照组和抗体处理接毒组迁移率、上清中bFGF、VEGF、NO显著低于接毒组。以上结果表明,PCV2感染诱导分泌的IL-8可调控内皮细胞bFGF、VEGF、NO分泌而影响猪髋动脉内皮细胞的迁移。     

猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMW S)组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析.结果表明,PCV2核苷酸序列较稳定,不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1 767 bp组成,彼此间核苷酸序列相似性达95.3%~99.8%,亲缘关系密切;与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70.1%~99.1%;与欧洲各地区毒株的相似性介于67.7%~98.8%;其中与美国的毒株(AY094619)差异性最大,介于69.4%~70.8%之间.     

猪PRRSV单独感染及与PCV2混合感染的免疫病理学研究

通过人工感染40日龄断奶仔猪建立PRRSV单独感染以及与PCV2混合感染病理模型,对两种感染所致猪免疫器官组织和外周血淋巴细胞的病理变化进行比较研究。结果表明PRRSV单独感染以及与PCV2混合感染均能引起猪的淋巴结指数升高,混感组多处淋巴结指数显著高于PRRSV单独感染组,病理组织学观察表明,指数升高并非缘于淋巴组织增生,而是急性渗出性或慢性特殊肉芽肿性炎症所致。PRRSV单独感染能引起免疫器官以淋巴细胞及巨噬细胞变性坏死为特征的急性炎症,而混合感染不但加重了上述病变,后期还造成脾脏严重的淋巴滤泡缺失和淋巴结肉芽肿性炎症。两种感染均可诱发不同程度的淋巴细胞和巨噬细胞凋亡,但混合感染时细胞凋亡更加严重且持续时间更长。凋亡主要见于早期,后期则主要表现坏死性病变。早期淋巴细胞凋亡以及后期淋巴组织坏死是造成免疫器官实质细胞缺失,机体出现免疫抑制的主要原因之一。