应用DNA条形码鉴定滇西北4种传统藏药绿绒蒿

绿绒蒿属植物是著名的高山花卉,其中大部分也是传统藏药。本研究对4种绿绒蒿(美丽绿绒蒿、滇西绿绒蒿、全缘叶绿绒蒿及总状绿绒蒿)进行DNA提取、PCR扩增和测序,运用Sequencher软件对所获序列进行拼接,应用Geneious软件比对序列,计算Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离并构建UPGMA系统聚类树等方法进行鉴定分析,探索鉴定这4种绿绒蒿的新方法,以保证绿绒蒿的质量及临床疗效。结果表明:条形码4个片段都具有较高的遗传多样性,其中rbc L的多样性较低,ITS的多样性最好;绿绒蒿属种间存在相当高的遗传分化;构建绿绒蒿属4个种的UPGMA系统分类树显示,4个种的分辨率很高,分种的支持率亦很高;4个条形码片段都可以找到特异性鉴定位点,从而快速区分4个种;植物类通用条形码rbc L、mat K、trn H-psb A及ITS适用于鉴定中药材绿绒蒿。     

山西省野生丽豆的DNA条形码物种鉴定

为了保护濒危物种丽豆(Calophaca)的生物多样性,测定天然分布于太原天龙山、晋中乌金山、甘肃庆城丽豆的ITS2和psb A-trnH序列,实施了DNA条形码物种鉴定。这3种产地分布的丽豆ITS2序列完全相同,同时psb A-trnH序列也完全相同,证明是同一物种。这两条DNA序列尚未被美国NCBI(National Center for Biotechnology Information,USA) DNA序列数据库收录。依据《中国植物志》记载,山西省分布丽豆种名为Calophaca sinica Rehd,测定的ITS2和psb A-trnH序列可以认为是Calophaca sinica Rehd的DNA条形码系列,可作为基于DNA条形码物种鉴定的对照序列。     

基于DNA序列分析的刚竹属系统树构建

提取刚竹属中毛金竹、毛竹、龟甲竹、人面竹、紫竹、白哺鸡竹、黄槽竹、芽竹、蓉城竹、红壳雷竹、假毛竹、金竹、黄纹竹等13个竹种的DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列以及maturase K(mat K)序列进行PCR扩增和序列测定。构建了与其亲缘关系接近的刚竹属6个种、牡竹属3个种共22个竹种基于ITS序列的系统发育树和刚竹属7个种、牡竹属3个种共23个竹种基于mat K的系统发育树,并探讨了其亲缘关系。结果显示,实验所用的大部分竹种分类结果与传统分类类似,但黄纹竹、毛竹与其他刚竹属竹种的遗传距离较远,却与牡竹属的竹种聚类,与传统分类相左。通过测序分析认为其为杂种的可能性较高,并由此推测杂种的存在是造成竹子分子分类困难的一大原因。     

基于ITS和cpDNA序列的梭梭和白梭梭物种分化

【目的】基于nrDNA和cpDNA 2种基因,探讨中国同域分布的梭梭和白梭梭的物种分化,分析2种基因的单片段及其片段组合对2种植物的物种鉴别力,并分析生态位分化的程度及其对物种进化的影响,为梭梭和白梭梭的系统发育和谱系地理等研究提供基础数据。【方法】基于2个nrDNA序列(ITS2、ITS1-ITS4)和3个cpDNA非编码区序列(trnS-trnG、rps4和trnV),对古尔班通古特沙漠南缘同域分布的梭梭和白梭梭共30个个体进行序列分析;利用距离法(基于Kimura 2-parameter)研究2种植物的遗传分化;基于贝叶斯方法分析个体间的分子系统关系;并利用距离法、系统发育树法、BLAST比对法和诊断特征法评价ITS和cpDNA的单序列及其组合对2种植物的物种鉴别力。在此基础上,利用生态位分析软件ENMTools V1.4定量分析梭梭与白梭梭生态位分化的程度。【结果】1)对于梭梭和白梭梭,2个ITS序列拼接比对的总长均为1 117 bp,G+C含量平均分别为34.74%和34.82%,总的信息位点数分别占片段总长的2.33%和1.43%; 3个cpDNA序列拼接比对的总长均为2 344 bp,G+C含量平均分别为59.62%和59.39%,信息位点数分别占片段总长的0.68%和0.43%。2)基于ITS和cpDNA序列组合构建的贝叶斯系统发育树都表明梭梭和白梭梭各聚为一支。3)基于ITS和cpDNA序列组合计算的2种植物的种间最小遗传距离均大于种内的最大遗传距离,并且种间种内都存在1个明显的距离间隙,表明本研究所用的ITS和cpDNA的序列组合可以作为鉴定梭梭和白梭梭的DNA条形码序列。4)基于4种方法评价的ITS和cpDNA序列对梭梭和白梭梭的物种鉴别力表明:2个ITS的单序列及其序列组合的鉴别率均为100%; cpDNA序列中,rps4的单序列及其与trnS-trnG,trnV的两两序列组合的鉴别率均为0,而trnS-trnG,trnV的单序列及其序列组合,以及trnS-trnG+trnV+rps4组合的鉴别率均为100%。5)生态位参数D值和I值的观察值和一致性检验的模拟值都集中在0.65和0.90左右,表明梭梭和白梭梭的生态位分化不明显。【结论】基于ITS和cpDNA序列组合,梭梭和白梭梭物种间的遗传分化明显,分子系统关系清楚; ITS和cpDNA序列组合都可以作为鉴定梭梭和白梭梭的DNA条形码序列;梭梭和白梭梭的生态位分化不明显,说明生态因素很可能对2种植物的分化与进化没有起到明显的作用,2种植物很可能也具有相近的进化历史。本研究的结论可以为梭梭和白梭梭的系统发育、遗传和进化研究提供重要的理论依据和数据支撑。     

基于花期差异和ISSR-PCR分析的不同茶梅品种间亲缘关系

【目的】为了明确不同茶梅品种之间的亲缘关系,为后续的良种筛选和种质资源的开发与利用奠定基础。【方法】以引自不同原产地的34个具有代表性的茶梅品种为研究对象,对其树形、叶质、花色、花瓣类型、花瓣数量、花期等6个形态学性状进行了观察记录和分类统计;在此基础上,采用试剂盒法,选择完整、健壮、表现良好的鲜叶,提取34个茶梅品种的基因组DNA,利用ISSR分子标记技术,采用10个优选的ISSR引物,对茶梅品种基因组DNA进行PCR扩增,使用NTsys软件构建品种间的聚类分析图。【结果】扩增得到142条重复性好、清晰稳定的PCR条带,其中多态位点数为136个,多态性条带的比例为95.77%。聚类分析结果表明,供试茶梅品种的遗传相似性系数为0.62～0.91;当遗传相似性系数为0.70时,供试的茶梅品种被聚成6个类群,类群Ⅰ和Ⅵ中都仅有1个茶梅品种,分别是‘立寒1号’与‘笑颜’;类群Ⅱ和Ⅳ中都包含了12个茶梅品种;类群Ⅲ和Ⅴ中都包含了4个茶梅品种。【结论】基于花期差异情况结合ISSR-PCR分析结果分析发现,34个茶梅品种间存在着丰富的遗传多样性,且各个类群间的亲缘关系均较远,加之不同类群中的茶梅品...     

不同引种黑莓品种的遗传多样性分析

【目的】开发适于黑莓Rubus spp.的EST-SSR引物,用于品种和种质的遗传多样性评价分析。【方法】基于前期获得的黑莓转录组数据,分析得到黑莓EST-SSR分子标记,筛查符合要求的SSR序列,设计合成127对较理想的EST-SSR引物进行扩增和多态性引物筛选,利用多态性好的引物用于18个引种黑莓栽培品种的遗传多样性分析。【结果】在127对引物中有125对可扩增出条带,有特异条带且大小符合预期的引物共有50对,50对引物中有45对具多态性的引物,占引物总数的36%,多数引物扩增的位点数为2~5。使用45对引物检测18个黑莓供试品种基因组DNA的多态性,共检测到191个等位基因变异,平均每个位点有4.24个等位基因,位点多态性信息含量为0.427~0.893,平均值为0.692。多态性最好的引物为Rh121,检测到8个等位基因,其次是Rh114和Rh118,均检测到7个等位基因。18份材料的遗传相似系数为0.49~0.88,表明品种间具有较丰富的遗传差异。利用UPGMA聚类,将18份种质分为3个类群,其中四倍体和多倍体黑莓品种明显归为不同类型,四倍体黑莓分为2类,相似育种产地的品种多聚在一起,推测与其品种遗传种质成分具一定相似性有关。【结论】EST-SSR标记可应用于黑莓品种种质遗传多样性分析,目前引种黑莓种质的遗传基础相对较窄。     

NaCl胁迫对2个蓝莓品种幼苗生长及离子吸收、运输和分配的影响

【目的】研究不同浓度NaCl处理下2个高丛蓝莓品种幼苗的盐响应,以揭示其盐适应机制,为耐盐蓝莓品种选育及合理栽培提供依据。【方法】以北高丛蓝莓‘蓝丰’和南高丛蓝莓‘奥尼尔’2年生扦插苗为材料,在盆栽条件下经0、100、200和300 mmol·L~(-1)NaCl溶液处理40天,研究幼苗干物质积累量、叶片受害情况以及矿质离子(Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Cl~-)含量变化及其在根、茎、叶中积累、运输与分布特征。【结果】1)随着NaCl浓度的增加,各器官干物质量逐渐降低,其中‘蓝丰’在低盐(100 mmol·L~(-1))处理下,干物质量降低不明显,在高盐(200~300mmol·L~(-1))处理下明显降低,而‘奥尼尔’在盐处理下干物质量明显低于对照;2个蓝莓品种盐害指数明显增大,但相同盐浓度处理下,‘蓝丰’盐害指数低于‘奥尼尔’。2)随着盐胁迫的加重,2个蓝莓品种幼苗各器官Na~+和Cl~-含量均明显增大,叶片盐离子积累量高于根和茎,各器官K~+含量降低,根Ca~(2+)和Mg~(2+)含量以及茎Mg~(2+)含量降低;‘奥尼尔’茎Ca~(2+)含量与对照无明显差异,而‘蓝丰’茎Ca~(2+)含量明显高于对照;2个蓝莓品种幼苗叶Ca~(2+)和Mg~(2+)含量总体上与对照无明显差异。盐胁迫下,‘奥尼尔’茎、叶Na~+和Cl~-含量以及根Cl~-含量均高于‘蓝丰’;而‘蓝丰’各器官Mg~(2+)含量均高于‘奥尼尔’。3)盐胁迫下,2个蓝莓品种根、茎、叶中K~+/Na~+、Ca~(2+)/Na~+和Mg~(2+)/Na~+值随盐浓度的增加呈下降趋势,且显著低于对照;在高盐处理下,‘蓝丰’叶离子比值高于‘奥尼尔’。4)盐胁迫下,2个蓝莓品种从根到茎的离子选择性运输能力高于对照;从茎到叶和从根到叶的离子选择性运输能力低于对照,其中‘蓝丰’从根到叶片钾和镁离子选择性运输能力强于‘奥尼尔’。【结论】低浓度盐胁迫对‘蓝丰’生长影响较小,对‘奥尼尔’生长影响较大;高浓度盐胁迫对2个蓝莓品种生长均产生较大影响。盐胁迫下,‘蓝丰’幼苗体内Na~+和Cl~-积累量低于‘奥尼尔’,各器官Mg~(2+)积累量高于‘奥尼尔’,保持体内离子平衡能力以及钾和镁的整体离子选择性运输能力强于‘奥尼尔’,这可能是其耐盐性强于‘奥尼尔’的原因。     

4个蓝莓品种果实发育期叶片矿质营养动态及其相关性

【目的】了解不同品种蓝莓树体对矿质元素的吸收规律及差异,并为细化蓝莓施肥管理措施提供参考。【方法】以兔眼蓝莓品种‘巨蓝’和‘灿烂’及南高丛蓝莓品种‘薄雾’和‘奥尼尔’为试材,果实发育期间定期采取果实附近的叶片,应用电感耦合等离子发射光谱仪测定并分析了叶片大量矿质元素磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)及微量矿质元素铁(Fe)、锰(Mn)、硼(B)、锌(Zn)、铜(Cu)含量动态及其相关性。【结果】4月22日—7月21日,4个品种叶片K和Cu含量整体呈下降趋势,Ca、Mg、Fe、Mn和B含量整体呈上升趋势,但‘巨蓝’的Ca、Fe、Mn含量在7月21日未出现上升;‘灿烂’‘薄雾’和‘奥尼尔’P含量均在7月21日出现明显回升,而‘巨蓝’P含量持续下降;Zn含量除‘薄雾’变幅较小外,其他3个品种Zn含量呈现"下降—回升"的变化趋势。相关性分析结果表明,K含量与B含量间呈显著负相关,而Ca含量与P、Mg、Fe、Mn、B含量间,P含量与Mg含量间,Mg含量与Fe、Zn、B、Mn含量间,Fe含量与Mn、B含量间,以及Mn含量与B含量间均呈显著正相关。【结论】除‘巨蓝’Mg含量相对不足外,4个品种叶片各元素含量均较充足。结合土壤理化性质可知,施肥时应注意增施有机肥,‘巨蓝’品种还应增施Mg肥。     

板栗实腐病菌rDNA-ITS的RFLP和测序分析

为了明确孝感本地板栗实腐病菌的种类及其多样性,对分离自孝感的11株板栗实腐病菌的ITS进行了测序和RFLP分析。用通用引物ITS4和ITS5扩增病原菌的ITS1-5.8S-ITS2区域,PCR扩增产物经EcoRⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ分别酶切,酶切结果用软件NTSYSpc2.1作聚类图。经ITS-RFLP分析得到了11条多态性DNA条带,在遗传相似系数0.72水平分为4个类群。并对PCR产物进行测序和BLAST分析,相似序列用MEGA5.1构建系统发育树。经形态学和ITS双向测序和比对分析,病原菌主要来源于3个属:Botryosphaeria(无性态Diplodia)、Neofusicoccum和Fusarium(有性态Gibberella),其中Neofusicoccum为引起板栗实腐病菌的新报道属。     

滇山茶多倍体栽培品种的细胞倍性

【目的】阐明滇山茶主要栽培品种的细胞倍性,以利于后期的遗传育种研究。【方法】采集昆明植物园滇山茶63个品种的嫩叶,并以二倍体怒江红山茶作为对照,利用流式细胞仪检测每个样本DNA含量的荧光强度,然后根据2C值估计细胞倍性。同时,每个倍性采集3个代表品种的茎尖和花药制作压片,在光学显微镜下进行染色体计数,验证流式细胞术的结果。【结果】在63个滇山茶品种中,DNA峰值最大的是‘恨天高’(304.43),2C值为18.32 pg;DNA峰值最小的为‘红霞迎春’(175.03),2C值为10.53 pg。峰值范围小于250、2C值低于15.00 pg的品种倍性被估计为六倍体,涉及的品种共29个,占被检品种总数的46.03%;峰值范围在250~300、2C值为15.00~18.00 pg的品种倍性被估计为八倍体,共涉及31个品种,占被检品种总数的49.21%;峰值范围大于300、2C值高于18.00 pg的品种倍性被估计为十倍体,涉及品种3个,占被检品种总数的4.76%。滇山茶代表品种‘五角绣球’(花药:n=45)、‘菊瓣’(花药:n=60)和‘恨天高’(茎尖:2n=150)的染色体计数结果与流式细胞术的倍性估计结果一致。【结论】滇山茶的栽培品种涉及六倍体、八倍体和十倍体,丰富的细胞倍性将为后期的杂交亲本选配、多倍体的遗传和进化等研究奠定基础。     

不同时间采收的贵州主栽蓝莓果实品质的综合评价

【目的】为了解采收时间对贵州主栽蓝莓果实品质的影响情况,从而为主栽蓝莓品种的栽培生产提供理论依据。【方法】以不同时间采收的贵州主产区3个产地(碧波、龙奔、小河边)的2个主栽蓝莓品种'灿烂'和'粉蓝'的果实为研究对象,对其外观形态(单果质量、果型指数、色泽等指标)、理化性质(出汁率、果汁pH值、含水量等指标)、食用品质(可滴定酸、总可溶性固形物、还原糖、固酸比、糖酸比等指标)及营养成分(花色苷、蛋白质、总酚、总黄酮)进行了测定,并采用主成分分析方法对变异系数大于10%的指标进行了降维分析,根据其主成分得分计算其综合评分并进行排序。【结果】测定结果表明:采收时间对不同产地和不同品种蓝莓果实的外观形态、理化性质、食用品质及营养成分的影响程度均存在差异。主成分分析结果表明:3个产地的'灿烂'和小河边的'粉蓝'的尾果果实品质的综合评分均较高,龙奔的'粉蓝'头茬果果实品质的综合评分最高;而3个产地的'灿烂'和龙奔的'粉蓝'的中间果果实品质的综合评分均最低,小河边的'粉蓝'头茬果果实品质的综合评分最低。【结论】采收时间对不同产地和不同品种蓝莓果实品质的影响存在较大差异,因此建议,应按品种、采收时间及产地分类分批进行采收、贮藏、鲜销及加工,以确保鲜销果实及加工用原料果实品质的稳定性。     

基于SRAP分子标记的苦楝种质资源遗传多样性分析

【目的】利用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记对来自17个省(区)的31个苦楝种源进行遗传多样性分析,为苦楝种质资源的保存和育种计划的制订提供依据。【方法】通过SRAP分子标记获得1/0数据矩阵,计算SRAP分子标记各项遗传参数,同时进行分子方差分析(AMOVA)。随后计算遗传距离矩阵并进行主坐标分析(PCo A)、邻接法聚类分析(Neighbour-Joining)以及遗传距离和地理距离Mantel相关性分析。【结果】从783对SRAP引物中筛选出的20对引物可扩增出257条清晰的条带,其中145条具有多态性。引物多态性信息指数(PIC)为0.262~0.478,均值为0.385。PIC值较高的10对引物,可扩增出56条特异多态带,可以作为快速鉴别苦楝种源的工具。AMOVA结果显示,38.96%的遗传变异来源于种源间,61.04%的遗传变异来源于种源内。山区的贵州册亨和黎平,云南勐腊和麻栗坡,湖南东安、炎陵和浏阳,四川达州,河北保定,安徽滁州种源的遗传多样性高于其他种源。邻接聚类法根据Nei’s遗传距离将31个种源分为东西2类,西部云南、四川、贵州和甘肃的8个种源构成类群Ⅰ,其他地区的23个种源构成东部类群Ⅱ。类群Ⅱ中北方的济南、保定、泰安、渭南和许昌5个种源聚为一小类,华南地区的屯昌、五指山、钦州和仁化种源聚为一小类,其他相邻和相近的种源大多聚在一起。PCo A分析的种源间双标图结果与邻接法聚类结果基本一致。种源内双标图显示相同种源内的单株大都聚在一起,且种源间和种源内双标图总体分布大体一致。Mantel检验结果表明,种源间遗传距离和地理距离相关性显著(r=0.256,P=0.003)。【结论】SRAP分子标记可以准确、有效地用于苦楝遗传多样性分析。苦楝遗传变异主要来源于种源内,而种源间基因交流有限。种源遗传多样性整体偏低,而部分山区种源遗传多样性较高。在选择高遗传多样性种源的基础上,苦楝选育应侧重种源内家系和单株选择。苦楝种源特征明显,地理环境差异对其遗传多样性具有一定的影响。31个种源大致可分为东西2类,东部种源从北到南有多个聚类中心,其种质资源应采用多点就地保存方式。我国苦楝遗传多样性起源中心或许存在于2类不同种源的生态过渡区。     

极小种群濒危植物盐桦叶绿体基因组特征分析

【目的】为了解析极小种群植物盐桦叶绿体基因组结构,筛选SSRs分子标记和桦属叶绿体基因组高变区,采用高通量测序技术完成盐桦叶绿体基因组测序并与其近缘种进行比对分析。【方法】采集盐桦幼叶,使用TIANGEN试剂盒提取DNA并利用HiSeq Xten测序平台进行测序。以欧洲矮桦叶绿体基因组作为参考,使用MITObim v1.8和NOVOplasty软件拼接组装盐桦叶绿体基因组,并利用生物信息学手段进行特征分析。【结果】利用质量控制后的30 000 000条clean data,成功拼接完成序列全长为160 648 bp的盐桦叶绿体基因组,NCBI登录号为MG674393。其中,大单拷贝(LSC)区段长度89 553 bp,GC含量33.7%,小单拷贝(SSC)区段长19 027 bp,GC含量为29.7%,2个反向重复区(IRs)区段均为26 034 bp,GC含量42.5%。成功注释了盐桦叶绿体基因组共114个基因,其中包括79个蛋白编码基因,31个tRNA基因和4个rRNA基因。盐桦叶绿体基因组含有91个SSRs位点,其中33个SSRs均由A或T组成。SSRs主要分布于LSC区,56个SSRs位于LSC区,13个SSRs位于SSC区,而IRs区有22个SSRs。对盐桦和欧洲矮桦叶绿体全基因组进行比对分析,结果显示ndhC-trnV、petA-psbJ、rpl22-rps19区域的核酸变异度(π0.2)显著高于其他区域,高变区的位置都位于LSC区,而IRs区和SSC区内2种植物变异度较小。正选择分析显示ycf1,rpoC1,rpl2与ndhA 4个基因出现正选择信号。盐桦、欧洲矮桦与其他双子叶植物共14条叶绿体全基因组序列通过MP、NJ方法进行聚类分析,MP和NJ树中的11个节点中有9个支持度为100%。支持盐桦和欧洲矮桦亲缘关系最近,桦木属物种与天目铁木在同一分支。【结论】通过高通量测序和生物信息学分析,得到盐桦叶绿体基因组。比对分析表明结构、基因组成和SSRs分布都与欧洲矮桦叶绿体基因组相似,二者在3个片段区域存在较高的核酸多态性,可作为桦属植物叶绿体基因组高分辨率的分子条形码。正选择分析确定有4个基因出现正选择信号(ycf1,rpoC1,rpl2,ndhA)。本研究结果可为极小濒危植物盐桦的保护工作提供重要的遗传背景信息。     

97个山杏无性系的遗传多样性及SSR指纹图谱

【目的】山杏是北方半干旱地区重要的生态经济型树种,种质资源异常丰富,形态鉴定与分类难度大。利用SSR分子标记研究山杏优选无性系的遗传多样性并构建指纹图谱,以期为山杏种质鉴定提供科学依据。【方法】根据山杏简化基因组测序结果,合成600对SSR引物,利用4个山杏无性系进行引物筛选,选出155对扩增条带清晰的引物,对97个山杏优选无性系进行PCR扩增。应用引物组合法构建指纹图谱,采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。【结果】利用155对SSR引物对97个山杏无性系进行扩增,共扩增出933个等位基因,每个位点的等位基因数为3~11个,平均为6.019个;各位点的多态性信息含量(PIC)为0.476~0.885,平均值为0.681,具有较高的多态性。50个山杏无性系在59个位点上具有特异等位基因,89个无性系在131个位点上具有特异基因型。采用5对引物(L56、X47H、L79H、P40H和X47)的组合可区分全部97个无性系,构建了指纹图谱。对97个山杏无性系进行亲缘关系分析,无性系间的遗传相似系数变化范围为0.669~0.943,平均值为0.757;基于遗传相似系数进行聚类分析,将97个无性系分为5大类,第1大类和第2大类下又分为3个亚类,分类结果与无性系的来源区域有明显的相关性。【结论】从600对SSR引物中筛选出155对,其扩增位点多态性较高、重复性较好。发现89个山杏无性系具有特异基因型,其中50个既具有特异基因型也具有特异等位基因。应用引物组合法构建了基于5对SSR引物扩增位点的山杏无性系指纹图谱。供试山杏无性系遗传差异较小,亲缘关系较近。研究结果可为山杏种质鉴别提供科学依据,也为山杏的育种工作奠定基础。     

桉树无性系与亲本及桉属其它种遗传关系分析

对桉属(Eucalyptus)的11个种和3个元性系的ITS序列进行了比对分析,桉属的不同种以及3个无性系的ITS长度范围为633～678 bp.分析表明,3个无性系的ITS为假基因,其ITS序列长度比近缘种长38～45 bp.因此,通过ITS引物扩增和测序可以将无性系与其它种类、品种或类型区分.系统发育分析表明,柠檬...     

猴头菇DNA条形码的构建及验证

为构建猴头菇品种专属的DNA条形码。应用分子生物学方法、选定β-tubulin基因作为条形码序列的目标基因,依据NCBI中猴头菇β-tubulin基因序列的全长,设计了一对用于扩增目标基因的引物:Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC;Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC。应用上述引物对现有的19个猴头菇的品种进行PCR鉴定。测序后的序列结合BLAST、Clustal、MEGA、BioEdit等软件分析、比对得到多态性位点,分析多态性位点设计出构建条形码序列的特异性引物。经验证表明,猴头菇RT9品种的3个特有的条形码成功获得。试验结果表明,实验成功获得的DNA条形码序列可以将猴头菇RT9品种与猴头菇的其它品种区分鉴定。     

基于SSR分子标记的枸杞遗传多样性研究

【目的】使用黑果枸杞的转录组数据开发适合枸杞的EST-SSR引物,用于分析评价枸杞品种和种质的遗传多样性,为黑果枸杞种质资源评价和新品种培育提供理论依据。【方法】基于NCBI公共数据库已经发表的黑果枸杞果实转录组数据,分析得到枸杞的EST-SSR分子标记,合成了符合设计标准的182对EST-SSR引物,经过扩增和多态性筛选后,将多态性好的引物用于30份枸杞材料的遗传多样性分析。【结果】在182对引物中,有176对引物可以扩增出条带,共筛选出20对多态性好、有特异性的引物,其多数引物扩增条带数为2～8条。使用20对引物在30份枸杞材料中共扩增得到121条条带,平均每对引物扩增出6.05条,有效等位基因数(N_e)的均值为1.473 1个,Nei’s多样性指数(H)的均值为0.291 7,Shannon信息指数(I)的均值为0.451 7,多态性信息含量(PIC)均值为0.667,30份材料的遗传相似系数为0.459 2～0.991 8,表明品种间具有较丰富的遗传差异。聚类分析结果表明,30份枸杞材料被分为6个组,黑果枸杞与红果枸杞明显归于不同类型,不同种源地的黑果枸杞可以明显区分,相同省区或相近地区的材料多聚在一组,由此推测,这与其种质遗传成分具有一定的相似性有关。整体聚类分析结果与供试材料来源信息基本对应。【结论】红果枸杞栽培品种之间的遗传距离较小,甘肃的黑果枸杞与青海、新疆的黑果枸杞材料之间其遗传多样性均存在较大差异,利用黑果枸杞转录组数据开发出的SSR分子标记,不仅适用于枸杞的遗传多样性研究,还可适用于黑果枸杞遗传多样性的分析与评价。     

多脉铁木叶绿体基因组的序列特征和系统发育

【目的】多脉铁木是中国特有种,为浙江省珍稀濒危野生植物和极小种群保护对象。在浙江,多脉铁木的野生植株数量极其稀少,低龄个体极少,种群面临衰退。叶绿体基因组在进化过程中相对保守,可为亲缘关系分析和系统发育研究提供有用信息。本研究在组装叶绿体基因组的基础上,对序列特征进行分析,以明确多脉铁木叶绿体基因组的大小、结构和基因组成等信息;通过系统发育分析,明确其与近缘种的关系和分类地位。【方法】利用CTAB法提取多脉铁木的基因组DNA,并构建测序文库,用Hi Seq X Ten进行高通量测序,策略为双端测序;借助Novo Plasty组装叶绿体基因组;用PCR方法克隆边界序列并进行测序验证; SSR的检测采用MISA软件;利用PhyML 3. 0构建系统发育树。【结果】去除接头和低质量的序列,共得到19 869 412条clean reads。序列组装结果表明,多脉铁木叶绿体基因组的全长为159 583 bp,具一个典型的四分体结构,大单拷贝区、小单拷贝区及反向重复序列的长度分别为88 514、18 953、26 058 bp。多脉铁木叶绿体基因组中共有131个基因,其中蛋白编码基因85个、tRNA基因36个、rRNA基因8个,其中的ycf1和ycf15为假基因,它们的序列长度均短于正常基因。多脉铁木叶绿体基因组上共有58个SSR,其中单碱基重复有53个。序列比对结果表明,多脉铁木与天目铁木的相似性最高,达99. 1%,与铁木的相似性最低,为98. 7%。构建系统发育树的最佳模型为GTR+G+I,其中的AIC(赤池信息标准)和BIC(贝叶斯信息标准)分别为556 643. 629 64和556 954. 642 07。系统发育分析结果表明,12种植物在发育树上可分为两大组,桦木族的日本桤木和红桤木聚为一组,榛族的10种植物聚于另一组;多脉铁木与铁木属其他3个种聚于同一分支,支持率均为100%。【结论】在高通量测序的基础上,组装完成多脉铁木的叶绿体基因组,它与天目铁木、毛果铁木和铁木叶绿体基因组的相似性较高,在系统发育树上聚为一组。多脉铁木叶绿体基因组的组装、序列比对和系统发育分析,可为后续开展遗传结构和群体遗传多样性研究奠定基础。     

基于cpDNA rps16序列分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐的遗传关系

【目的】通过测序法分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐在叶绿体rps16序列上的遗传差异,旨在分析三者之间在叶绿体基因上的变化特点和规律,探讨其种间的遗传关系。【方法】选取兰考泡桐、白花泡桐和毛泡桐各15个样本,对其提取的DNA用PCR扩增获得特异片段,并将其纯化与测序。利用软件Clustal X 2.0对所得序列进行排序;运行MEGA 4软件,进行多序列比对,分析其序列特征,并计算出K2P遗传距离。【结果】(1)对获得的rps16序列进行测定分析,得兰考泡桐序列长度分别为932 933 bp;白花泡桐序列长度为932 bp;毛泡桐序列长度分别为916918 bp。对所得rps16序列进行排序后的长度为938 bp,平均GC含量为34.31%。3个种所代表的个体之间共有10个变异位点,占整个序列长度的1.07%。其中有9个变异位点属于碱基插入或缺失类型,占变异位点总数的90%,占整个序列长度的0.96%。有1个变异位点属于碱基替换类型,占整个变异位点总数的10%,占整个序列长度的0.11%。(2)整个rps16片段的序列共有10个变异位点,其中兰考泡桐与白花泡桐在总的变异位点上,具有一致的碱基位点9个,占总变异的90%。而兰考泡桐与毛泡桐相比,没有相同的碱基。【结论】根据三种泡桐的rps16序列的序列特征和变异位点的分析,表明在叶绿体遗传方面,兰考泡桐具有与白花泡桐更多相似的遗传物质,其亲缘关系较近。综上所述,推测兰考泡桐与白花泡桐可能来自同一母系遗传。     

越南黄檀锈病病原菌的鉴定

【目的】描述在海南省澄迈县新发现的越南黄檀锈病的症状及其孢子形态特征,并提取DNA进行ITS序列扩增测序,从而鉴定该病的病原。【方法】实地调查该病害的发生和为害情况,观察并记录病害症状。采集该病新鲜夏孢子,制备浓度为1×105个·m L-1的夏孢子悬浮液,对越南黄檀健康叶片进行涂抹接种,采用单孢子堆分离法获得1株越南黄檀锈病纯培养物HNCM1。利用孢子形态观察结合ITS序列分析的方法对该病原菌进行鉴定。【结果】越南黄檀锈病为害寄主叶片与枝条,以当年生嫩枝叶为主,每年暴发2次,4月上旬—6月上旬与9月中旬—11月上旬为2个盛发期,重病株发病率可达75%以上。夏孢子堆初期为黄色或橙黄色,粉状,一般长在叶背面圆形或椭圆形小突起上,直径约0.2~2.5 mm,严重时连接成片引起嫩叶卷曲或畸形,后期在叶片上形成锈褐色枯死斑,导致老叶枯死或早落;夏孢子圆形、椭圆形,表面有小刺,萌发孔不明显,大小为(13~21)μm×(10~16)μm,壁厚约1μm。冬孢子堆苍白色、胶质状,天气转凉时偶见,呈圆形,小于夏孢子堆;冬孢子椭圆形、棍棒形或近纺锤形,大小为(19~28)μm×(13~16)μm,无色,光滑单细胞,具柄,长约7~10μm,壁厚约1μm。该病原ITS序列扩增产物长约750 bp,产物经双向测序拼接后得到640 bp,进行Blast比对,结果表明,病原菌ITS序列与Gen Bank中已有的序列同源性较低,最高仅为90%。【结论】引起海南省澄迈县越南黄檀锈病的病原菌为紫檀无眠单胞锈菌,夏孢子ITS序列在Gen Bank中尚无同源性较高序列,获取HNCM1菌株的Gen Bank登录号为KU301795。