新疆野果林疫霉菌对植物叶片致病性的测定与分析

[目的]从病原菌和寄主两个维度,探究新疆野果林中疫霉菌对野果林内主要树种叶片的致病性,了解新疆野果林衰退的可能原因及疫霉对新疆野果林造成的潜在风险。[方法]利用菌丝块接种离体叶片的方法,将诱捕自新疆野果林的5种疫霉(Phytophthora plurivora、P.gonapodyides、P.lacustris、P.gregate、P. sp.)接种到苹果、杏、山楂和核桃的健康离体叶片上,一周后观察测量、计算病斑大小,并用R软件对数据进行双因素方差分析和作图。[结果]实验结果及数据分析表明:供试5种疫霉菌株接种到4种植物叶片上后,病斑大小存在显著性差异。其中,P.plurivora和P.lacustris产生的病斑较大,最大分别为18.68 cm~2和14.14 cm~2;寄主植物中,核桃和杏树叶片产生病斑较大,最大分别为18.68 cm~2和9.55 cm~2。[结论]供试树种和菌种对叶片病斑大小都有显著影响;供试5种疫霉对苹果、杏、山楂、核桃叶片的致病性依次为:P.plurivoraP.lacustrisP.gregate≈P.gonapodyidesP. sp.;苹果、杏、山楂和核桃这4种植物叶片对以上5种疫霉菌的感病性依次为:核桃杏山楂苹果。     

新疆野苹果根围木霉分离鉴定及生防特性研究

为了给防治新疆野苹果病害提供生防性能优良的木霉菌株,利用孟加拉红平板分离法进行新疆巩留县野苹果根围木霉菌株分离,通过形态特征和ITS rDNA序列比对进行菌种鉴定,利用平板对峙试验检测分离木霉抑菌能力,用NBT染色和根部观察检验木霉诱导后新疆野苹果幼苗叶片活性氧含量、抗病和促生能力。结果表明:分离鉴定出俄罗斯木霉22株,渐绿木霉13株,哈茨木霉4株。从长势和产孢量等特性上看,俄罗斯木霉T7和哈茨木霉T2为新疆野苹果根围优势生防木霉菌种。哈茨木霉T2对尖孢镰刀菌的抑菌率为75.47%,对链格孢菌的抑菌率为78.17%。俄罗斯木霉T7对尖孢镰刀菌的抑菌率为79.66%,对链格孢菌的抑菌率为91.53%;NBT染色发现木霉处理后野苹果苗叶片活性氧含量降低,叶片染色颜色更浅。总之,木霉能有效抑制病原菌生长,能有效减少新疆野苹果幼苗中活性氧含量,促进和保护根系生长。本研究为防治新疆野苹果病害防治提供生防性能优良的木霉菌株,为苹果病害的生物防治提供可以借鉴的方法。     

新疆野苹果树内生细菌分离与鉴定及其对3种苹果病原菌的抑制作用

【目的】从我国优良的种质资源新疆野苹果树中分离和筛选用于苹果病害防治的内生细菌,以期为苹果病害生物防治提供新的菌种资源。【方法】采用稀释分离法和组织分离法从新疆野苹果枝干中分离内生细菌,通过平板对峙试验筛选出对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉3种苹果树的致病菌均具有显著抑菌效果的菌株,结合形态学、生理生化特征及16S r DNA序列分析,明确分离和筛选出内生细菌的分类地位,经离体接种试验证实其是否具有致病性。【结果】共分离获得内生细菌217株;筛选出对苹果3种病原菌均具有较强抑菌作用的菌株7株(M-m7、M-m12、M-r12、P-m9、P-m11、L-m12、P-r21),对葡萄座腔菌的抑菌率分别为77. 00%、72. 60%、76. 60%、60. 64%、65. 96%、65. 81%、71. 79%,对胶孢炭疽菌的抑菌率分别为69. 85%、64. 95%、68. 87%、68. 37%、56. 12%、53. 54%、65. 66%,对苹果拟茎点霉的抑菌率分别为77. 63%、79. 22%、72. 60%、69. 37%、70. 27%、69. 30%、71. 05%。经鉴定,M-m7、M-m12、P-m11、L-m12为枯草芽孢杆菌,M-r12、P-m9为贝莱斯芽孢杆菌,P-r21为解淀粉芽孢杆菌,接种试验证明这些生防菌株对苹果枝条不具致病性。【结论】从新疆野苹果枝条中筛选并鉴定出对苹果3种病原菌具有抑制作用的内生细菌菌株7株,对苹果树不具致病性。     

基于ITS和β-tubulin基因分析的居间疫霉菌系统发育

【目的】对我国亚热带部分森林中的疫霉菌及其所致病害进行了系统调查和分析,研究疫霉菌的种类和遗传多样性,探讨疫霉菌的系统发育关系,为林木疫病的防治提供理论依据。【方法】利用健康叶片诱捕林间溪流里的疫霉菌,对有症状的叶片组织进行分离纯化,显微镜下根据其菌丝分枝和结构特征,初步判定为疫霉菌。对菌株的ITS和β-tubulin基因进行PCR扩增和测序,将序列拼接后,用MAFFT 7.0、PAUP 4.0 beta10、Mr Bayes 3.2.6及PhyML 3.0等软件进行基因序列系统发育分析。【结果】分离鉴定得到46株中国新记录种,通过进一步培养和显微镜下观察,其形态特征与居间疫霉菌Phytophthora intercalaris相吻合。拼接之后得到完整的ITS序列为847~849 bp,与参考菌株(KT163268)序列一致性为99.29%~99.53%;β-tubulin序列均为882 bp,与参考菌株(KT163336)序列一致性为99.43%~99.66%。系统发育分析结果显示供试菌株与居间疫霉菌以100%的支持率聚为一支。本研究不仅增加了居间疫霉菌的菌株数量,也扩大了该菌的分布范围,同时也增加了中国疫霉菌的种类。【结论】居间疫霉菌种内不同地理来源的菌株之间具有较高的序列一致性,但是也存在一些碱基的差异,从而形成不同的基因型。     

河南省臭椿炭疽病病原鉴定

[目的 ]鉴定引起河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园臭椿炭疽病病原菌,为该病害的防控提供依据。[方法 ]采用常规组织分离法进行病原分离,利用形态学和多基因系统发育分析相结合的方法对分离菌株鉴定并进行致病性测定。[结果 ]从病组织中共分离获得11株菌株,所有菌株在PDA培养基上菌落特征表现一致,正面菌落先白色后灰色,背面黑色,分生孢子为圆柱状,两端钝圆,单孢,无色,初步鉴定分离菌株为炭疽菌Colletotrichum spp.。选取代表菌株CH-1和CH-3接种臭椿叶片,有伤条件下接种均能引起臭椿叶片发病,发病叶片症状与田间一致,柯赫氏法则验证成立;经多位点基因(ITS、ACT、TUB2、CHS-1和GAPDH)系统发育分析,发现分离菌株与果生炭疽菌C. fructicola聚集在同一个分支上,支持率达到99%。[结论 ]本研究首次采用形态学结合多基因系统发育研究,明确发生在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园的臭椿炭疽病为果生炭疽菌C. fructicola所致。     

新疆野苹果种群受损现状

[目的]为新疆野苹果种群的资源保护和开发利用提供参考.[方法]以新疆野果林不同自然分布区的野苹果为调查对象,在不同海拔、不同坡向、不同坡度设置20个样方,进行野苹果种群受损情况的实地调查.[结果]样地中未受损野苹果树为376棵,占总数的34.03％,其中有357棵为野苹果树苗,占未受损野苹果总数的94.68％.受损新疆...     

不同抗旱措施下新疆野苹果移栽苗土壤水分及叶片生理响应

[目的]探讨不同抗旱措施下新疆野苹果移栽苗土壤水分及叶片生理响应,筛选最佳的节水抗旱技术.[方法]以1年生新疆野苹果幼苗为材料,采用传统移栽、覆盖移栽、管件防护移栽、容器育苗移栽、生物制剂移栽等抗旱措施进行试验,测定不同措施处理下幼苗移栽地7—9月主要生长季的土壤含水量,并测定和分析其叶片叶绿素含量、抗氧化酶活性及渗透...     

哈茨木霉T28发酵液提取物对致病疫霉的抑制及对体内酶活性的影响

为了更深入的探讨哈茨木霉菌株T28发酵液乙酸乙酯提取物对致病疫霉生长的抑制作用和机制,采用不同浓度的发酵液乙酸乙酯提取物对致病疫霉进行抑菌试验以及对其体内几种生理代谢酶活性影响进行试验.结果表明:不同浓度的提取物对致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发、孢子囊释放游动孢子均有抑制作用,其中稀释浓度为10倍和100倍时抑制效果较好,均与浓缩液无显著性差异.经提取物处理后致病疫霉菌体48 h,与对照相比其保护酶(SOD、CAT、POD、GSH-Px)活性分别下降89.06％,86.96％,97.47％和97.63％,糖代谢酶(HK、PK、LDH)和TCA有氧分解代谢酶(SDH、MDH)分别下降93％,89.56％,88.5％,97.66％和97.43％,能量代谢酶(ATP)活性下降了98.5％和98.67％,MDA含量上升60.98％.研究表明哈茨木霉菌株T28发酵液乙酸乙酯提取物可降低致病疫霉菌体的代谢酶活性,提高菌体MDA含量.提取物处理后致病疫霉菌体遭受损坏,其糖代谢、三羧酸循环、能量代谢等生理活动不能正常进行,这可能是哈茨木霉菌株T28发酵液乙酸乙酯提取物抑制致病疫霉生长的机制之一.     

新疆野苹果叶片内生细菌的分离鉴定及其促生特性

【目的】找寻有益于新疆野苹果植株生长发育的优良菌株,为新疆野苹果叶片微生物资源的研究与利用提供依据。【方法】以新疆野苹果叶片为研究对象,利用稀释分离法分离内生细菌,通过16SrDNA基因测序和序列比对,对菌株进行分类。通过配制不同功能培养基对内生菌株进行功能鉴定,并进行盆栽试验,研究其促生特性。【结果】共鉴定出24株菌株,分属于2个属的6个种,其中芽孢杆菌属Bacillus 23株、赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus 1株。通过对这24株菌株进行功能鉴定,筛选出4株具有解磷作用的菌株及3株具有分泌IAA功能的菌株。盆栽促生试验结果表明,筛选出的优质功能菌株HDM4和HC2均具有促进幼苗生长的能力,促生效果较为明显的是叶绿素含量和维生素C含量。与对照组相比：经HDM4菌液处理后叶绿素含量和维生素C含量分别提高了50.7%和43.4%;经HC2菌液处理后叶绿素含量和维生素C含量分别提高了47.5%和58.0%;经HDM4菌液处理后株高和茎直径分别增加了12.4%和6.4%;经HC2菌液处理后株高和茎直径分别增加了29.5%和37.2%。【结论】芽孢杆菌属广泛分布于新疆野苹果叶片中...     

不同居群新疆野苹果生理响应差异与抗寒性的关系

为给苹果抗寒砧木的筛选提供参考依据,分别在新疆维吾尔自治区伊犁州的新源县、巩留县、霍城县、托里县、额敏县等5个居群新疆野苹果林中采集果实,取其种子进行层积处理,然后分别种在营养袋中,待其自然生长3个月后,将生长良好的整株幼苗进行低温处理,取其叶片进行相关试验,测定和分析其相对电导率、可溶性糖含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性。结果表明:随着处理温度的降低,新疆野苹果的相对电导率、25~0℃时的可溶性糖含量与脯氨酸含量、25~-5℃时的MDA含量与可溶性蛋白含量、25~0℃时的SOD活性、25~-5℃时的POD活性、25~0℃时的CAT活性和处理温度均呈负相关,而0~-10℃时的可溶性糖含量、-5~-10℃时的MDA含量、0~-10℃时的SOD活性、-5~-10℃时的POD活性、0~-10℃时的CAT活性与处理温度均呈正相关;不同居群新疆野苹果的各项生理指标在变化过程中均产生了差异,不同居群新疆野苹果的抗寒性由强到弱依次为:托里县野苹果、额敏县野苹果、巩留县野苹果、霍城县野苹果、新源县野苹果。     

欧美杨溃疡病的病原鉴定

从河南濮阳、山东菏泽等地的欧美杨溃疡病发病林地采集病样96份,经分离、纯化、归类出10种分离物,其中镰孢属(Fusarium)真菌占优势.以离体苗干水培接种和盆栽苗接种,经致病性测定,明确分离物Mz01为致病菌株.经形态学鉴定,Mz01为茄镰孢菌(Fusarium solani).采用真菌通用引物对分离物Mz01进行PCR扩增,对其核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区测序,并将测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,分子鉴定与形态学鉴定一致.茄镰孢菌作为我国欧美杨溃疡病的病原菌系首次报道.     

昆明芦荟根腐病病原菌的分离及鉴定

芦荟具有较高的经济和药用价值,研究芦荟根腐病的病原菌有利于芦荟产业的发展。采用纯培养技术对芦荟根腐病的病原菌进行分离鉴定,并利用离体根部接种法对其进行致病性测定。结果表明,从感染芦荟的根中分离得到一株根腐病病原菌;依据其形态结构特征和ITS测序初步鉴定为尖孢镰刀菌。致病性测定发现,利用分离出病原菌接种的芦荟根段均有病斑,其中刺伤和无刺伤的根段的病斑率分别高达94.4%和66.7%。     

木麻黄青枯病菌的分离及强致病菌株的筛选

[目的]筛选出强致病菌株用于木麻黄抗病育种研究工作。[方法]在广东沿海木麻黄青枯病发病区采集病根,开展病原菌两种不同分离方法的比较研究,对分离出的31个病株进行16s rRNA测序鉴定及致病性测定。[结果]采用稀释分离法及根系溢出法在TTC培养基上共分离出了31个病原菌株,根系溢出法操作简便,杂菌含量低,分离率在60%左右,可作为常规稀释分离法的补充。31个菌株进行分子鉴定,只有22个菌株扩增出了特异性条带,经测序比对确定这22个菌株为青枯菌。青枯菌株致病性测定结果显示菌株致病性在无性系间、菌株间及菌株与无性系间的交互作用均具有极显著差异(P0.01),不同接种方法间菌株致病性相关系数值较小,介于0.496 6~0.731 0之间,即室内水培接种与小苗盆栽接种不存在密切的直线相关关系。[结论]综合选择在不同无性系及不同接种方法中均具有较强致病性的GL-2、H、M、TC-1、F、Q菌株作为下一步木麻黄种质资源抗性鉴定及抗病育种研究试验菌株。     

核桃基腐病的病原鉴定

从新疆阿克苏地区核桃园发病的核桃树上采集的病样经分离、纯化得到2种菌.经田间人工接种致病性测定,明确了引起核桃基腐病的病原菌.根据形态特征和培养特性初步鉴定核桃基腐病的病原菌为寡雄腐霉.采用真菌通用引物对分离的病原菌进行PCR扩增,核糖体DNA内转录间隔区测序,并将测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,分子鉴定与形态鉴定结果一致.寡雄腐霉作为核桃基腐病病原菌系首次报道.     

转TSRF1基因尾叶桉的培育及其广谱抗病性

以尾叶桉U6无性系无菌种子苗下胚轴为外植体,通过对不同生长调节剂的优化组合,建立尾叶桉高效再生体系.应用正交试验设计,优化尾叶桉遗传转化体系.经PCR和Southern杂交检测表明,TSRFI基因已整合到尾叶桉基因组中;转基因植株灌根接种青枯菌后,转基因植株表现出发病延迟,抗性提高,抗性相关酶活性显著增强.转化植株离体叶片对疫霉菌抗性明显增强.荧光定量PCR的结果表明转基因植株接种致病菌后TSRF1基因表达量得到提高.研究结果表明,转TSRF1基因尾叶桉表现出一定的广谱抗病能力.     

新疆巩留县杏果实斑点病病原菌鉴定

[目的]鉴定引起新疆巩留县杏树果实斑点病病原菌,研究造成杏树果实病害的原因,为当地杏树防治工作提供依据。[方法]采用常规组织分离法分离得到罹病杏真菌菌株,利用传统形态学观察和分子系统学分析相结合的方式对所分离出菌株进行分类鉴定及其致病性检测。[结果]杏果病斑处的病原菌在显微镜下观察到分生孢子形态与经PDA培养基培养后观察到分生孢子形态均与Thyrostroma carpophilum（Lév.） B.Sutton所产生分生孢子一致;将分离获得的3株真菌的rDNA-ITS片段测序后与NCBI参考序列进行多重序列比对的结果显示,其序列与T.carpophilum一致性为100%;在基于ITS基因序列构建的系统发育树中,3株菌与T.carpophilum聚在同一分支。在接种了T.carpophilum后,杏果实和叶片均产生明显病斑并且从其所产生的病斑上再次分离到所接菌,满足柯赫氏法则。[结论]从新疆巩留县杏果实病斑处分离获得的3株真菌,经鉴定为引起杏穿孔病的病原菌T.carpophilum。这是该菌首次在该地区发现并报道。     

枣缩果病互隔链格孢菌的潜在寄主研究

[目的]发掘枣缩果病菌可能存在的潜在寄主,为探究枣缩果病的初侵染来源寻找突破口。[方法]用gfp标记的枣缩果病初侵染互隔链格孢菌CN193菌株(CN193::gfp)的孢子悬浮液,以刺伤和无伤两种方式,接种选自枣园周围栽植的番茄、烟草、苹果、梨、毛白杨和加杨,然后,将发病部位病健交界处的组织置于加有10μg·mL~(-1)潮霉素B的PDA培养基上培养,荧光显微镜观察发病组织和从各寄主上分离获得的病菌菌丝。[结果]刺伤接种7 d后,除烟草外,其他刺伤的材料均发病,发病率依次为番茄果实45.8%、苹果果实79.2%、苹果叶片75.0%、梨果实56.3%、梨叶片52.1%、毛白杨叶片66.7%和加杨叶片54.2%;无伤处理的仅番茄发病,其他材料和对照组均未发病。番茄病部组织的荧光清晰可辨;在发病的番茄果实、苹果果实和叶片、梨果实和叶片、毛白杨和加杨离体叶片病部组织分离后长出的菌丝中,均可以观察到明显的荧光。[结论]枣缩果病菌能成功侵染番茄、苹果、梨、毛白杨和加杨,并可使各寄主植物产生与番茄黑斑病、苹果褐纹病、梨黑斑病和杨树叶枯病相同的症状,推断番茄、苹果、梨、毛白杨和加杨为枣缩果病菌的潜在寄主,扩大了枣缩果病菌初侵染来源的范围,为进一步开展枣缩果病的防治拓宽了渠道。     

转Bt基因欧洲黑杨抗虫稳定性及其对天敌昆虫的影响

1997-2001年,对新疆玛纳斯平原林场的转Bt基因欧洲黑杨试验林进行了食叶害虫(杨尺蠖)和杨梦尼夜蛾危害调查,转基因试验林叶片平均损失率均低于10%,试验林地虫口密度由1997年的18头·m-2降低到2001年的8头·m-2,而对照林地虫口密度却呈上升趋势. 2005年,位于北京怀柔的转Bt基因欧洲黑杨试验林受杨尺蠖危害,叶片损失率不超过20%,而当地其它杨树林叶片损失率高达90%.在转Bt基因欧洲黑杨林(新疆玛纳斯)中,寄生靶标害虫的天敌种类、数量和寄生率均高于对照林,对从试验林中采集的靶标昆虫的蛹进行接种试验,与对照相比,寄生蜂出蜂率和数量均无明显差异,寄生蜂也无异常,说明转Bt基因欧洲黑杨未对天敌昆虫产生明显不利影响.     

山东牛心柿炭疽病菌的分离鉴定及致病性

【目的】对侵染牛心柿引起炭疽病的病原菌进行分离鉴定,分析其致病性,初步构建其侵染谱,为柿树病害的病原诊断和防治提供理论依据和技术支持。【方法】通过组织分离法和单孢分离法从感病牛心柿的果实、叶片和嫩梢中分离病原菌,根据菌落和孢子形态特征及其 rDNA-ITS 序列分析进行种类鉴定,采用以菌饼进行伤口和非伤口接种、孢子悬浮液进行喷雾接种的离体接种试验分析其致病性。【结果】从感病牛心柿果实、叶片和嫩梢中分离获得9个病原菌分离物,菌落及孢子形态特征显示均为炭疽菌。以真菌转录间隔区通用引物 ITS6和 ITS4为引物,以菌丝总 DNA 为模板,扩增获得病原菌 rDNA-ITS基因片段,经 rDNA-ITS序列分析和系统进化树的构建,将该病原物鉴定为柿树炭疽菌,将其 rDNA-ITS 基因序列提交到 GenBank 数据库(基因登录号 KF010811)。牛心柿炭疽病菌和次郎炭疽病菌对不同品种柿树的致病性相同,均无差异性,对果实的致病性比叶片强;接种7天后,叶片无病斑或病斑较小,菌饼无伤口接种几乎不发病,在叶片上不产生病斑,果实上病斑较小;不同的接种方式在果实和叶片上产生的病斑大小为：菌饼伤口接种＞孢子悬浮液接种＞菌饼无伤口接种;牛心柿炭疽病菌和次郎炭疽菌对桃、苹果、梨等果树的叶片和果实均不致病。【结论】柿炭疽病菌具有一定的专性寄生性,对除柿树外的其他果树不致病,且在遗传上有一定的保守性,因地理距离产生的变异很小,这些特性对于柿炭疽病的防治具有重要意义,在一定程度上可以避免或削弱因病菌的遗传变异而产生的抗药性,从而有利于炭疽病的防治。在柿树有伤口时最易侵染致病,雨天或高湿度的情况下经孢子侵染致病的可能性居其次。在田间管理时注意避免造成柿树伤口感染,或者避免在下雨天气进行修剪,可最大程度地减轻或消除柿树炭疽病菌的侵染以及柿炭疽病的发生和流行,从而在一定程度上解决该病流行而造成的减产问题。     

等温扩增技术快速检测棕榈疫霉

【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了以基因间隔区(intergenic spacer,IGS)为靶标的快速、简单、特异和灵敏的棕榈疫霉菌的检测方法。以IGS基因为靶序列,利用环介导等温核酸扩增技术,设计了多组LAMP引物,同时建立并优化了LAMP反应体系与条件,最终筛选出1组扩增反应结果较好的LAMP引物,采用该组引物进行特异性、灵敏度和实际应用的验证。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果。【结果】整个检测过程在等温64℃条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。在特异性试验中,通过HNB显色只有在棕榈疫霉菌株中能观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌的供试菌株仍为紫色的阴性反应;在灵敏度试验中,PpIGS-LAMP技术检测灵敏度达到10fg.μL~(-1)目标菌纯DNA;在实际应用中,PpIGS-LAMP技术能够快速检测出采自田间的木薯根部土壤中目标菌和人工接种发病木薯组织样品的目标菌。【结论】本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测棕榈疫霉,建立了1种快速、高灵敏度、高特异性、可视化的棕榈疫霉的LAMP检测方法。建立的棕榈疫霉菌的LAMP检测方法在80 min内可完成待检样品的检测过程,显著缩短检测时间,降低基层部门的检测成本,为棕榈疫霉引起疫病的检疫和所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。