奶山羊细菌人工染色体基因文库构建的初步研究

细菌人工染色体(BAC)文库是进行动物基因组学研究的一个重要手段,为配合山羊乳腺生物反应器的研究,对构建山羊基因组BAC文库进行了初步研究。用H indⅢ酶对莎能奶山羊基因组进行部分酶切,用CHEF(箝位匀强电场)二次电泳法回收150 kb大小条带,电透析回收高分子量(HMW)DNA;同时以BAC载体pB eloBAC 11为材料,分别采用限制性内切酶H indⅢ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,将该载体自连并通过凝胶回收线性段DNA,获得了可用于构建BAC文库的线性载体。将HMW与载体进行连接,电击转化感受态DH 10β大肠杆菌,一次转化得到近2 000个克隆。插入片段大小为50~200 kb,基本满足建库的需要。     

利用离果山羊草3C染色体诱导簇毛麦2V染色体结构变异

【目的】簇毛麦是普通小麦的一个近缘物种,它具有许多抗病基因,在小麦育种中起重要作用。抗白粉病基因Pm21已被南京农业大学细胞遗传所成功地转移到小麦背景中,并被广泛地用于小麦育种实践。为了进一步转移和利用定位于簇毛麦2V染色体上的有用基因,如抗眼斑病基因、抗条锈基因和护颖颖脊刚毛基因,为小麦育种创造新种质。【方法】通过普通小麦农林26-离果山羊草3C二体异附加系与小麦-簇毛麦2V（2D）二体代换系杂交,综合运用染色体C-分带、基因组原位杂交、染色体构型分析和分子标记分析。【结果】从杂种F２和F３中鉴定出涉及簇毛麦2V结构变异的异染色体系7份,包括纯合缺失系1份（Del 2VS•2VL-）,易位系4份,其中纯合易位2份（初步推断为T3DS•2VL,T2VS•7DL）、小片段易位1份（T6BS•6BL-2VS）和中间插入易位1份（T2VS•2VL-W-2VL）,等臂染色体1份（2VS•2VS）和单端体1份（Mt2VS）。利用可分别追踪2VS 和2VL的分子标记Xwmc25-120和NAU/STSBCD135-1进行PCR分析,进一步证明这7份异染色体系中涉及簇毛麦2V染色体片段。【结论】涉及2V短臂的单端体Mt2VS,等臂染色体2VS•2VS和易位系T2VS•7DL在护颖颖脊上有簇状分布的刚毛,而涉及2V长臂的易位系T3DS•2VL无刚毛,进一步证实簇毛麦护颖颖脊刚毛基因位于2VS。离果山羊草3C染色体可有效诱发簇毛麦2V染色体结构变异。     

小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因（TaCKX5）的克隆及其染色体定位

【目的】克隆小麦的TaCKX基因并对其序列进行生物信息学分析,明确TaCKX基因在小麦基因组中的分布情况,以期为今后深入研究小麦CKX基因以及利用该基因进行小麦重要农艺性状的遗传改良奠定基础。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,通过小麦缺体-四体对其进行染色体定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1 596 bp,编码531个氨基酸,含有CKX基因家族典型的功能位点FAD-binding domain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。使用中国春缺体-四体将TaCKX5定位于小麦第三同源群。系统发育分析表明,CKX基因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。【结论】分离获得了普通小麦TaCKX5基因全长,TaCKX5分布于小麦染色体3A、3B、3D上,与水稻OsCKX5基因直向同源。     

长片段水稻细菌人工染色体DNA的亚克隆文库的构建

利用超声波振断法将水稻细菌人工染色体 (BAC)基因组文库———Nipponbare库中的一个BAC克隆 (E5 0 )振断 ,产生许多大小不同的DNA随机片段 ,回收其中 1 7～ 3 5kb的片段 ,并将这些随机片段克隆入质粒载体pUC18,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆BAC文库     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。     

木耳菜染色体制片优化及核型分析

【目的】优化木耳菜Basella alba染色体制片条件,并了解其核型特征,为今后研究不同类型木耳菜的亲缘关系和系统进化提供理论基础。【方法】以木耳菜品种‘大叶木耳菜’为材料,对影响染色体制片效果的取材部位、预处理时间和解离时间等条件进行优化,并进行核型分析。【结果】木耳菜主根根尖的分裂相细胞和中期分裂相细胞比例最多;0.002 mol·L-1的8-羟基喹啉预处理6 h,木耳菜染色体收缩性最好,形态最佳,分散性好;在60℃下1mol·L-1的HCl解离8 min,木耳菜染色体着色良好且细胞质透明,对比度高。木耳菜的核型公式为2n=2x=44=38m(2SAT)+6sm,染色体相对长度组成为20 M2+22 M1+2 S,染色体长度比为1.93,染色体相对长度变化范围为3.13%~6.06%,着丝粒指数变化范围为35.19%~47.86%,臂比值变化范围为1.09~1.84,第10、16、17对染色体为近中部着丝粒染色体,其余均为中部着丝粒染色体,第13对染色体具有随体,木耳菜核型不对称系数为57.89%,核型按分类标准属1A型。【结论】明确了木耳菜染色体制片的最佳条件参数,并从细胞遗传学角度揭示了木耳菜的核型特征。     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

河南大尾寒羊染色体核型与G-带分析

【目的】研究河南大尾寒羊染色体核型和G-带。【方法】分离培养河南大尾寒羊外周血淋巴细胞,制备染色体标本和G-带标本,分析河南大尾寒羊的染色体核型和G-带。【结果】河南大尾寒羊二倍体染色体数目为2n=54,公羊核型54,XY;母羊核型54,XX。27对染色体中包括26对常染色体和1对性染色体,常染色体中有3对为中着丝粒染色体,23对为端着丝粒染色体;性染色体中,X染色体为最大的端着丝粒染色体,Y染色体为最小的中着丝粒染色体。河南大尾寒羊G-带与其他绵羊品种的G-带基本一致。【结论】河南大尾寒羊的染色体数目为:2n=54,公羊核型54,XY;母羊核型54,XX。河南大尾寒羊G-带与其他绵羊品种的G-带基本一致。     

P.syringae pv.glycinea M-18生产冠菌素补料发酵工艺优化研究#br#

【目的】提高丁香假单胞菌大豆致病变种高产突变株P. syringae pv. glycinea M-18,发酵生产冠菌素的产量。【方法】研究补料分批发酵过程中初始葡萄糖浓度、葡萄糖补加浓度、补加时间、补加次数、补加三氯化铁的浓度及pH对发酵产生的影响,并在 5 L发酵罐中进行放大试验。【结果】在 5 L发酵罐中,自发酵后84 h起,保持葡萄糖浓度在 5-2 g•L-1,初始葡萄糖浓度为10 g•L-1,发酵后84 h每升发酵液补加0.005 mmol三氯化铁,发酵过程中用 40 g•L-1 的MgCO3来调控pH在 6.7 左右,与对照相比冠菌素的产量显著提高,最高达 31%。【结论】在发酵过程中将葡萄糖控制在一个较合适的范围内可以显著提高P. syringae pv. glycinea M-18发酵生产冠菌素的产量。     

P. syringae pv. glycinea M-18生产冠菌素补料发酵工艺优化研究

【目的】提高丁香假单胞菌大豆致病变种高产突变株P. syringae pv. glycinea M-18,发酵生产冠菌素的产量。【方法】研究补料分批发酵过程中初始葡萄糖浓度、葡萄糖补加浓度、补加时间、补加次数、补加三氯化铁的浓度及pH对发酵产生的影响,并在5 L发酵罐中进行放大试验。【结果】在5 L发酵罐中,自发酵后84 h起,保持葡萄糖浓度在5—2 g.L-1,初始葡萄糖浓度为10 g.L-1,发酵后84 h每升发酵液补加0.005 mmol三氯化铁,发酵过程中用40 g.L-1的MgCO3来调控pH在6.7左右,与对照相比冠菌素的产量显著提高,最高达31%。【结论】在发酵过程中将葡萄糖控制在一个较合适的范围内可以显著提高P. syringae pv. glycinea M-18发酵生产冠菌素的产量。     

普通小麦-簇毛麦T5VS·5DL易位染色体对小麦主要农艺性状、品质和白粉病抗性的遗传效应分析

【目的】分析普通小麦-簇毛麦T5VS·5DL易位染色体对主要农艺性状、品质性状及白粉病抗性的遗传效应,了解T5VS·5DL易位染色体通过雌雄配子的传递情况,筛选便于育种利用的共显性分子标记,进一步明确T5VS·5DL易位系的高代回交品系在育种改良中的利用价值。【方法】分别以扬麦13、扬麦15为轮回亲本的高代T5VS·5DL易位系回交品系(BC4F4)及其分离群体(BC5F2)为材料,利用GISH及5VS特异分子标记对这些材料进行了鉴定;在大棚及大田2种环境下调查了这些材料的株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等主要农艺性状,并对这些材料的水溶剂保持力、碳酸钠溶剂保持力、蔗糖溶剂保持力、乳酸溶剂保持力、蛋白和籽粒硬度等品质性状进行了分析;还利用白粉菌混合生理小种对这些材料的苗期(二叶期)和成株期(抽穗期)进行了接种鉴定。【结果】含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系的株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等主要农艺性状与其轮回亲本相比,2种环境下的差异均不显著,表明簇毛麦5VS染色体臂代替普通小麦5DS染色体臂后,对产量性状的补偿性较好,没有显著的不利影响。品质性状的分析结果表明,含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系的籽粒硬度值(SKCS)均显著低于其轮回亲本,表明簇毛麦Dina/Dinb基因型比普通小麦的Pina/Pinb基因型具有更软质胚乳特性;另外,含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系的水溶剂保持力与碳酸钠溶剂保持力也显著低于轮回亲本,而蔗糖溶剂保持力、乳酸溶剂保持力及蛋白质含量的差异不显著,表明T5VS·5DL易位染色体对弱筋小麦品质指标可能有一定的正向效应。白粉菌混合生理小种接种鉴定的结果表明,在二叶期,含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系及其轮回亲本均高感白粉病,但在成株期含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系高抗白粉病,而其轮回亲本仍高感白粉病,表明含有T5VS·5DL易位染色体高代回交品系携带白粉病成株抗性基因。对BC5F2群体单株的白粉病及T5VS·5DL易位染色体鉴定的结果表明,所有含有T5VS·5DL易位染色体的单株均高抗白粉病,无T5VS·5DL易位染色体的单株均高感白粉病,推测一个显性的白粉病成株抗性基因与T5VS·5DL易位染色体共分离。同时在分离群体中,纯合易位染色体单株数、杂合单株数及无易位染色体单株数之比,经χ2测验符合1﹕2﹕1分离比例,表明T5VS·5DL易位染色体在小麦背景中遗传传递正常。通过对5VS特异分子标记的扩增条件及带型分析发现,共显性EST分子标记5EST-237、Pinb-1,扩增条件简单,特异带型易于识别,可以利用这些标记对T5VS·5DL易位染色体进行分子标记辅助选择。【结论】鉴于T5VS·5DL易位系良好的品质及抗病特性,建议在弱筋小麦的育种项目中加以利用。     

一株玉米肠致腐菌的16S rDNA鉴定及其防腐剂复配优化

 【目的】从发黏、黏稠汁液渗出败坏的玉米肠中分离获得1株导致产品腐败的菌株ym11,为构建控制技术,提高玉米肠安全水平,对该菌进行鉴定和防腐剂优化。【方法】采用16S rDNA序列分析对该菌进行鉴定,并通过MIC测定其对不同防腐剂的敏感性,利用响应曲面法对防腐剂复配进行优化。【结果】该菌属枯草芽孢杆菌属,同源性相似度达97%。对乳酸链球菌素、聚赖氨酸、尼泊金乙酯较敏感,MIC分别为39、39和125 mg•L-1。响应曲面优化结果显示,当乳酸链球菌素、聚赖氨酸、尼泊金乙酯浓度分别为11.30、10.90和4.80 mg•L-1时,可使基质中的ym11降低2个数量级。【结论】该菌属于枯草芽孢杆菌属,利用复合防腐剂可有效对其杀灭。     

盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL分析

【目的】定位盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL位点,为分子标记辅助选择小麦耐盐性状提供基因位点和连锁标记。【方法】以小偃54×京411重组自交系群体为材料,在盐胁迫条件下检测调控小麦苗期MRL、     RDW、SDW和TDW及其相对性状的QTL位点。【结果】共检测到调控小麦苗期4个性状及其相对性状的25个QTL位点,分布在1A、2A、2D、3A、4A、4B、5B、5D、6B、7A和7B共11条染色体上,贡献率在4.4%-25.5%。其中有15个QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B、5D染色体的5个遗传区间,其余10个QTL位点各自分布于不同的染色体区段。检测到的5个贡献率大于10%的位点分别位于3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1。【结论】多数调控小麦耐盐性的QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B和5D染色体上,3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1携带所有5个贡献率在10%以上的QTL位点。     

矮牵牛细胞的长期离体培养及再生植株的ISSR分析

 【目的】实现矮牵牛细胞的长期离体培养和再生，不但可以获得矮牵牛体细胞突变体，从中选出优良株系，而且可以为研究外源基因在矮牵牛细胞增殖与分化过程中的稳定性提供技术体系。【方法】以重瓣矮牵牛叶片为外植体，使用不同浓度BA与NAA的组合在黑暗条件下诱导愈伤组织。在不同光条件下，将愈伤组织在MS+ BA 2.0 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH 与 MS+ BA 0.5 mg•L-1+0.5 mg•L-1 NAA+200 mg•L-1 CH两种培养基进行愈伤组织3年多的继代培养，并利用筛选的8个引物对20个再生植株的总DNA进行ISSR分析。【结果】不同的生长素与分裂素配比诱导的愈伤组织状态明显不同，继代后的愈伤组织在低激素培养基上分化出不定芽，再生芽复壮后可得到正常植株。对再生植株的总DNA进行ISSR分析发现，再生植株之间存在很大的遗传变异。【结论】矮牵牛愈伤组织在高BA浓度培养基上可长期继代保存；在低激素培养基上可实现植株再生。长期离体培养矮牵牛是获得其突变体的有效方法。     

瑞华麦523PPO活性及1BL/1RS易位相关基因的分子检测

【目的】了解小麦品种瑞华麦523及其亲本郑麦9023和烟1604的PPO和1BL/1RS易位相关基因的遗传信息,旨在提高优质小麦品种选育的效率。【方法】利用小麦PPO活性基因的分子标记PPO18、PP0-B5、PPO16和PPO29及1BL/1RS易位的分子标记H20,检测小麦品种瑞华麦523及其亲本相关基因的等位变异及来源。【结果】小麦品种瑞华麦523在2AL染色体上PPO等位基因为PPO-A1a基因型,与亲本郑麦9023一样,为高活性PPO,不含亲本烟1604的低活性PPO;在2BL染色体上PPO等位基因为A型,与亲本一致,是高活性PPO;在2DL染色体上PPO等位基因为PPO-D1b基因型,与亲本郑麦9023一样,是一个高活性PPO,不含亲本烟1604的低活性PPO;利用分子标记H20检测表明,瑞华麦523和亲本郑麦9023一样,是一个非1BL/1RS易位系。【结论】瑞华麦523是一个具有高活性PPO、非1BL/1RS易位系的小麦品种,其小麦PPO和1BL/1RS易位相关基因主要来自母本郑麦9023,为该品种的推广应用和培育优质小麦新品种提供理论参考。     

喷施ABA对小麦籽粒谷蛋白组分含量及GMP粒度分布的影响#br#

【目的】探讨喷施外源激素ABA引起小麦籽粒谷蛋白组分及谷蛋白大聚合体(glutenin macro-polymer, GMP)粒度分布的变化,为激素调控改善小麦籽粒品质提供理论依据。【方法】以冬小麦品种山农8355和山农15为试验材料,通过大田试验研究喷施外源ABA对小麦籽粒谷蛋白组分含量及GMP粒度分布的影响。【结果】在孕穗末期和籽粒形成期喷施ABA(浓度12 mg&#8226;kg-1,用量45 mL&#8226;m-2)均能提高籽粒粗蛋白及谷蛋白含量,同时,籽粒中高、低分子量不溶性谷蛋白含量均有所增加。特别是在孕穗期喷施ABA,山农8355和山农15两品种籽粒中高、低分子量不溶性谷蛋白含量与对照相比均达到显著水平,但喷施ABA对籽粒中可溶性谷蛋白含量影响相对较小。不论是孕穗期还是籽粒形成期喷施ABA均能增加GMP含量与产量,并改变籽粒中GMP的粒度分布,尤其是对其体积及表面积分布影响相对较大。相关分析表明,高、低分子量不溶性谷蛋白、GMP含量及GMP/Pr.比值均与GMP小颗粒(d<15 um)粒度分布呈现负相关,与大颗粒(d≥15 um)粒度分布的关系呈正相关。【结论】 喷施外源ABA可以改变籽粒中谷蛋白组分及GMP粒度分布,从而影响小麦籽粒品质。     

喷施ABA对小麦籽粒谷蛋白组分含量及GMP粒度分布的影响

【目的】探讨喷施外源激素ABA引起小麦籽粒谷蛋白组分及谷蛋白大聚合体(glutenin macro-polymer,GMP)粒度分布的变化,为激素调控改善小麦籽粒品质提供理论依据。【方法】以冬小麦品种山农8355和山农15为试验材料,通过大田试验研究喷施外源ABA对小麦籽粒谷蛋白组分含量及GMP粒度分布的影响。【结果】在孕穗末期和籽粒形成期喷施ABA(浓度12 mg.kg-1,用量45 mL.m-2)均能提高籽粒粗蛋白及谷蛋白含量,同时,籽粒中高、低分子量不溶性谷蛋白含量均有所增加。特别是在孕穗期喷施ABA,山农8355和山农15两品种籽粒中高、低分子量不溶性谷蛋白含量与对照相比均达到显著水平,但喷施ABA对籽粒中可溶性谷蛋白含量影响相对较小。不论是孕穗期还是籽粒形成期喷施ABA均能增加GMP含量与产量,并改变籽粒中GMP的粒度分布,尤其是对其体积及表面积分布影响相对较大。相关分析表明,高、低分子量不溶性谷蛋白、GMP含量及GMP/Pr.比值均与GMP小颗粒(d15 um)粒度分布呈现负相关,与大颗粒(d≥15 um)粒度分布的关系呈正相关。【结论】喷施外源ABA可以改变籽粒中谷蛋白组分及GMP粒度分布,从而影响小麦籽粒品质。