小麦转TPS基因植株的获得及其初步功能鉴定

为了探索利用基因工程改良小麦抗旱性和耐盐性的途径,通过基因枪法将具有抗旱和耐盐碱功能的海藻糖合酶(TPS)基因导入普通小麦品种CB9945,获得了转TPS基因的小麦植株,对T0代植株进行了PCR检测,对T2代植株进行了叶片涂抹除草剂检测并进一步进行了验证,鉴定出15个转基因株系.采用模拟抗旱、耐盐环境,对15个转基因株系进行了初步功能鉴定,发现转TPS基因小麦植株的抗旱、耐盐能力得到了一定程度的提高.     

花粉管通道法介导小麦抗病相关基因的转化和抗锈性鉴定

为了筛选小麦的新抗病基因,进而培育抗病种质材料,以小麦品种小偃22、小偃6和西农1376为受体,利用花粉管通道法将防御素基因alfAFP、脂质转运蛋白基因LTP和抗菌肽基因spCEMA转入栽培品种中,并对转基因植株进行了目的基因和bar基因的PCR鉴定,获得了转化alfAFP基因和LTP基因的转基因后代,总体转化率为0.135％.对转基因后代进行的条锈病抗性鉴定,发现alfAFP基因对小麦抗病性提高有一定的作用.     

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TaPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TaPR-1的功能,利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化.研究结果表明,金粉用量为250.0 μg,轰击距离9cm的轰击参数最为理想,GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89.8%和33.7个.采用此轰击参数,将TaPR-1基因导入扬麦158幼胚,经3～5 mg/L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株,经PCR、Southern杂交分析,其中2株为阳性植株,转化率为0.11%.对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定,初步结果表明,转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别.     

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TαPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TαPR-1的功能，利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化。研究结果表明,金粉用量为250．0μg．轰击距离9cm的轰击参数最为理想，GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89．8％和33．7个。采用此轰击参数．将TαPR-1基因导入扬麦158幼胚．经3～5mg／L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株．经PCR、Southern杂交分析．其中2株为阳性植株．转化率为0．11％。对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定．初步结果表明，转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别。     

基因枪法获得玉米转基因植株的研究

采用基因枪轰击转化技术将含有抗除草剂chlorsulfuron基因AHAS的PCD220质粒导入玉米愈伤组织,并再生出具有抗该除草剂的转基因植株,同时研究了影响玉米基因枪转化效率的因素。基因枪轰击时,金粉用量、轰击次数及轰击距离对愈伤组织的转化率有较大影响。转化时,以金粉用量100 μg/枪、轰击2次、发射点与靶细胞的距离9 cm最合适。对所获得的转化植株进行PCR分析及Southern杂交鉴定,部分转化植株呈PCR阳性和明显的杂交信号,说明抗除草剂绿黄隆的基因AHAS已整合到玉米基因组当中,将转基因植株进行自交,获得了T₀代的种子。     

转RD29A:DREB1A融合基因小麦的获得及其抗旱性研究

为了提高小麦的抗旱能力,通过转基因将拟南芥 RD29A:DREB1A转入到小麦品种陇春30中,成功获得三个单拷贝本底DREB1A蛋白低表达水平的纯合转基因家系,并在干旱胁迫下测定了其生理指标及产量相关农艺性状。结果表明,与陇春30相比,转基因小麦的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD、CAT和POD活性都显著提高,H₂O₂含量、MDA含量和相对导电率均显著降低,株高、穗长、穗粒数、千粒重、地上生物量显著增加,说明 RD29A:DREB1A外源基因的导入能够显著增强陇春30的抗旱性。     

基因枪介导的转 TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶之一,在维持细胞能量供应和植物抗逆性方面具有重要作用。本研究以耐旱型小麦品种长武134及干旱敏感型小麦品种郑引1号为材料,利用基因枪法将 TaGAPDH8基因分别转化这两种小麦的幼胚愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR鉴定,最终得到4个下调表达的长武134株系(CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13)和8个上调表达的郑引1号株系(ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17)。对生长于大田的T_2代转基因植株在乳熟期的生长状况进行了测定,获得了与对照相比有明显表型差异的植株。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了T_3代小麦株系中 TaGAPDH8的表达量,结果表明,4个长武134株系中 TaGAPDH8基因的表达量分别为对照的0.53、0.75、0.21和0.78倍,而8个郑引1号株系中目的基因的表达量分别为对照的3.02、1.22、2.15、1.36、4.02、1.87、1.48和1.97倍。本研究获得了与对照存在明显表型差异的T_2代及稳定遗传目的基因的T_3代小麦株系,为后续的试验提供了研究材料和基础。     

转抗菌肽B基因和bar基因籼稻植株的再生

 运用基因枪法将含有bar基因和cecropin B基因的质粒pCB1导入籼稻品种特青的幼胚细胞,筛选后得到3株转基因植株。PCR检测和Southern杂交结果表明,外源基因已整合到水稻基因组中。转化当代植株表现出对Basta很强的抗性,同时也增强了对水稻白叶枯病的抗性。     

转TPSP融合基因小麦植株的获得及抗旱性初步鉴定

为了培育抗旱小麦新材料,在构建舍大肠杆茵海藻糖-6-磷酸合成酶基因(otsA)和海藻糖-6磷酸磷酸酯酶基因(otsB)融合基因TPSP的表达栽体pBS-ATPSP的基础上.利用花粉管通道法对小麦品种豫麦34和豫麦18进行了遗传转化.两个品种共处理2 495朵小花,获得T0代种子1 611粒.两个品种分别获得T1代小麦植株857和659株,经PCR鉴定转基因植株分别为11株和7株.通过半定量RT-PCR技术对4个T2代转基因株系中融合基因TPSP的表达分析显示,3个株系中TPSP基因受水分胁迫而诱导表达,其中2个株系在温室进行的干旱胁迫鉴定中表现出较强的抗旱能力.     

基因枪介导法获得转BtCry1Ac基因抗虫玉米植株的研究

利用基因枪介导法将含有Cry1Ac基因的质粒转入玉米愈伤组织,获得转Bt基因玉米植株,对所获得的转基因植株进行PCR分析和金标免疫试纸鉴定。结果表明,部分转化植株呈阳性,说明目的基因已经整合到玉米基因组中。将转基因植株自交获得T1代种子,对T1代植株进行田间抗虫鉴定,结果表明,与对照相比转基因玉米植株的抗虫活性明显强于非转基因植株。     

Tae-miR9677小串联模拟靶标(STTM)表达载体构建及小麦的遗传转化研究

小串联模拟靶标(Short tandem target mimic,STTM)技术是一种新开发的miRNA功能研究方法。Tae-miR9677作为一种新发现的在小麦穗部特异性高表达的miRNA,其功能至今未知。为了进一步探索Tae-miR9677的功能,构建了Ubiqutin(UBI)启动子启动的Tae-miR9677 STTM过表达载体,并通过基因枪介导法对小麦品种绵阳19幼胚愈伤组织进行转化。结果表明,3 683个愈伤组织经过PPT(Phosphinothricin)筛选,最终分化获得42株再生植株;利用特异性引物进行PCR检测,鉴定出8株T0代阳性植株。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

小麦品种“陕253”PDI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶（PDI）,运用RT-PCR方法克隆出小麦品种＂陕253＂PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典型的异构酶活性的催化位点-CGHC-和内质网驻留信号肽-KDEL-。构建该基因的原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中经IPTG诱导表达融合蛋白,并对表达蛋白进行了纯化。SDS-PAGE及Western-blot检测证实融合蛋白诱导表达并纯化成功。     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定

小分子热休克蛋白(SHSP)广泛存在于各类生物体中且在生物发育和逆境响应过程中发挥重要作用。我们克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),序列分析表明该基因编码区为477bp,可编码一个含158个氨基酸的多肽,分子量约17.6kD。序列分析显示该类SHSP在不同的植物中是保守的,在分类上隶属于CI类。实时定量RT-PCR分析显示热激处理可显著增强该基因的转录;Western blotting分析显示该蛋白大小与预期一致,且其含量在热激处理时大幅度增加。这些结果一致表明OsSHSP17.6可能参与了水稻热应激反应,这为进一步鉴定OsSHSP17.6的功能提供了基础。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数.PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPC cDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株.初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料.     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析

为解决农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化效率较低的难题,以春小麦Bobwhite成熟胚为外植体,分析植物激素、愈伤组织预培养时间、侵染时间和共培养阶段干燥处理对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的影响,并在遗传转化处理中辅以3个组织再生相关基因(TaSERK1、TaSERK2、TaNiR)的qRT-PCR分析。结果表明,愈伤组织预培养阶段添加适量的2,4-D和Picloram均可诱导成熟胚愈伤组织的形成,但是2mg·L~(-1)Picloram培养基中愈伤组织的胚萌发率为20.78%,远高于2,4-D诱导的胚萌发率(11.38%);共培养阶段对农杆菌侵染的愈伤组织进行干燥处理能适当提高愈伤组织的转化效率;qRT-PCR分析发现再生相关基因TaNiR相对表达量的增加能适当提高愈伤组织的转化率。