用PCR与ELISA、RPLA对照检测腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1

用PCR方法时14个奶牛场分离得到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌(金葡茵)124株,隐性乳腺炎金葡茵213株,山羊临床型乳腺炎金葡菌12株进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.see和tst基因的分子调查,结果表明:奶牛标本肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎为1.41%,山羊标本为33.3%.奶牛标本产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,山羊标本产生肠毒素的类型以SEC为主.对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金葡菌同时用ELISA和RPLA检测,3种方法检测结果基本一致.     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌超抗原的检测

用PCR方法对分离到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌124株.隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌213株,进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed,see和tst基因的榆测.结果表明:奶牛临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎金黄色匍萄球菌肠毒素基因的阳性率为1.41%,奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,对于肠毒素基因和tst基因PCR阳件的金黄色葡萄球菌同时用ELISA和RPLA两种方法进行检测,3种检测方法结果基本一致.     

应用双重PCR方法对奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素进行分型

溶血毒素是一种胞外毒素,是金葡菌主要毒力因子之一.金葡菌人源菌株多数产α-溶血素,而从动物分离的菌株多产β-溶血素,但是引起奶牛乳腺炎的金葡菌中α、β型未见相关报道.试验根据GenBank公布的α和β溶血素序列,设计双重PCR引物,对在山东省内20多个规模化奶牛场乳腺炎病例中分离得到的金葡菌提取模板,检测奶牛乳腺炎金葡菌溶血素基因型,为研制奶牛乳腺炎金葡菌基因工程疫苗提供科学的依据.试验建立了双重PCR快速检测金葡菌溶血毒素分型的方法,此法特异性好,准确性高,检测快速,证实应用此法对奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素进行分型是可行的.     

中国北方奶牛金葡菌乳房炎感染现状及耐药性和流行类型研究进展

奶牛乳房炎,尤其是由金黄色葡萄球菌(金葡菌)感染引起的隐性乳房炎是最难以防控的奶牛常见病。近五年来,本课题组对中国北方六个省市九个荷斯坦牛场的生产群高体细胞数(SCC)和低SCC奶牛以及临床乳房炎奶牛进行了十一批次采样,共采集奶样1 112头份,分离出191株金葡菌,所检测牛的平均金葡菌感染率达11.7%,其中生产群奶牛金葡菌感染率为12.4%,临床乳房炎牛为10.8%。对这些金葡菌进行药敏试验以及毒素基因检测,发现氯霉素和阿米卡星对金葡菌有较强抑制性,毒素基因检出率最高者是杀白细胞素基因PVL(70.2%)。依据金葡菌PFGE分型结果绘制中国北部及华东地区奶牛乳源金葡菌的流行图谱。结合国内外相关研究结果,对比分析了国内外奶牛金葡菌乳房炎的感染情况以及金葡菌的耐药性、毒素基因和流行类型,并提出了降低奶牛感染金葡菌乳房炎的相关策略。     

动物源金黄色葡萄球菌分离株mecA基因的表达及耐药性分析

为明确动物源金黄色葡萄球菌(SA)的耐药状况,使用微量肉汤稀释法分离45株金葡菌,并进行9种药物的药敏试验,筛选出耐耐甲氧西林金葡菌(MRSA)菌株,使用聚合酶链反应(PCR)检测mecA基因。结果表明,除了万古霉素、莫匹罗星外,金葡菌对其他药物均产生了耐药性,MRSA的检出率为51.1%;mecA基因检出率为51.1%,MRST内mecA基因携带率明显高于甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)。     

牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究

为研究牛乳金黄色葡萄球菌 SP-3分离株携带超抗原肠毒素的基因型，设计合成了金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素基因 SEA-SEE 及 TSST-1特异性引物，并以其固有基因 femA 和 femB 为阳性对照，以分离菌株 DNA 为模板，经 PCR 扩增菌株携带的毒素基因。结果表明，SP-3分离株和阳性对照菌株均含有femA 和 femB 基因，且牛乳分离株携带 sea、sec、sed 和 tst-14种超抗原肠毒素基因，为开展动物源超抗原毒素基因系统分型及有效防控金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基础。     

奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一，其不仅给奶业生产造成严重损失，而且携带毒素基因的金黄色葡萄球菌在适当环境温度、pH、介质下可产生毒素，影响乳产品质量安全，危害人体健康。金黄色葡萄球菌常产生的、临床意义较大的毒素为肠毒素（SEs）、剥脱毒素（ETs）和中毒休克毒素-1（TSST-1）三类。国外有较多奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒素基因流行情况的调查报道，国内少有这方面的研究。因此，本文就我国重要奶产地呼和浩特地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的sea、seb、sec、sed、see、eta、etb、tst等8种常见毒素基因的流行情况进行调查研究，以期为食源性疾病的监控和分子检测提供科学依据。     

金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究

为了解从生鲜乳中分离得到的31株金黄色葡萄球菌的耐药性和肠毒素分布情况,用微量肉汤稀释法进行药敏试验,用PCR方法进行肠毒素的检测和分型。结果表明,31株金黄色葡萄球菌耐药率在50%以上的抗菌药有7种,药耐药率小于10%的有3种;敏感率大于50%的抗菌药有6种,敏感率小于10%的有5种。31株金黄色葡萄球菌毒素基因携带率为93.5%,同时携带2种及以上毒素的菌株占67.7%,有SEA基因的占38.7%,含其他传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占40.4%,携带新发现的毒素基因SEG、SHE、SEI和SEJ的菌株占67.7%。说明本次试验中的31株金黄色葡萄球菌对6类13种抗菌药都有不同程度的耐药性,且多重耐药现象比较严重。生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,且携带新发现的肠毒素基因较多。     

多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌

产气荚膜杆菌根据产生4种主要毒素（α－β、ε、τ－毒素）可分为5种类型A－E型。在该研究中依据产气荚膜杆菌的5种毒素基因的序列，设计了5对PCR引物，建立了多重PCR方法，该方法可以快速区分5种类型的产气荚膜杆菌。并对68份环境样品（生活污水、生物肥料）进行检测和基因分型，共检出55株产气荚膜杆菌，其中A型产气荚膜杆菌50株，占总数的90％以上，B型、C型、D型只占5％，未检出E型产气荚膜杆菌，所有的分离株没有发现带有肠毒素。结果表明，目前环境中主要存在的菌型为A型菌，其他菌型的产气荚膜杆菌很少，而多数是非致病性产气荚膜杆菌。     

蜂胶对金黄色葡萄球菌毒力因子的抑制作用

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是临床非常重要的致病菌之一,是引起奶牛和山羊乳房炎最重要的病原菌.目前,全世界有三分之一的奶牛患有奶牛乳腺炎,每年因乳腺炎造成的损失高达350亿美元[1].     

牛源金黄色葡萄球菌生物被膜与毒素基因检测及agr分型

旨在对牛源金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）的生物被膜、耐药性、毒素基因和agr基因型进行研究，并分析agr基因型与毒素基因之间的相关性。分别用微量滴定板法、药敏纸片法和PCR对S.aureus的生物被膜、耐药性和毒素基因进行检测，用多重PCR对S.aureus进行agr分型。结果表明，336株牛源S.aureus均能形成生物被膜，其中，形成中等（++）和强（+++）生物被膜的S.aureus分别占52.1%和47.9%。药敏试验结果显示，S.aureus对青霉素耐药最为严重，耐药率达91.7%，其次是红霉素、卡那霉素、克林霉素和庆大霉素，耐药率分别为89.6%、72.9%、66.7%和60.4%，而所有S.aureus对呋喃妥因和利奈唑胺均表现为敏感。PCR检测结果显示，黏附素基因fnbA检出率最高，达99.7%，其次是icaD、icaA、clfA和cna，检出率分别为98.2%、89.6%、86.0%和56.0%，bap基因检出率最低，为14.6%。肠毒素基因sea的检出率为26.5%，其次是seb（8.3%）和sec（6.8%），毒素基因tst的检出率占8.3%。分型结果显示，agr Ⅰ型S.aureus是主要的流行菌株，占77.1%，agr Ⅱ、agr Ⅲ和agr Ⅳ型S.aureus流行率分别为14.0%、4.8%和2.1%。统计分析结果表明，agr Ⅰ型S.aureus更具有携带多种毒素基因的潜力，而agr Ⅳ型S.aureus无毒素基因携带潜力。综上表明，牛乳腺炎性S.aureus对常见的抗菌药物耐药严重，毒素基因分布多样，agr Ⅰ型是奶牛乳腺炎性S.aureus主要的基因型，且具有携带多种毒素基因的能力，其潜在威胁应引起重视。     

荷斯坦牛乳源金黄色葡萄球菌流行性及其与乳源总菌群的耐药性分析

本研究旨在检测并对比分析中国北方地区3个荷斯坦牛场乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)的流行情况及乳汁中总菌群的抗生素耐药性。试验采集北方地区3个荷斯坦牛场的生产群奶样、大罐奶样和临床型乳房炎牛奶样共181份,首先采用Baird-Parker选择性培养基对金葡菌进行分离纯化;再采用特异性PCR方法鉴定含金葡菌特异基因nuc的金葡菌菌株;最后采用琼脂稀释法检测奶样中总菌群及金葡菌对14种抗生素的耐药性。结果发现,181份奶样带菌率为100%;金黄色葡萄球菌检出率为16.03%,分离纯化了48株金葡菌。奶样总菌群耐药性检测结果表明,中国北方地区3个荷斯坦牛场对于β-内酰胺类抗生素(苯唑西林、氨苄西林、头孢西丁、头孢哌酮)耐药性均较高,达89%以上;对红霉素、利福平、四环素、万古霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、阿莫西林/克拉维酸的耐药性达80%以上;对氯霉素的耐药率过半;仅对阿米卡星耐药率较低(18%~58%)。对金葡菌耐药性检测结果显示,3个牛场金葡菌对环丙沙星、头孢西丁和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑有较高耐药性,但均对阿米卡星、氯霉素、加替沙星和万古霉素敏感。3个牛场绝大多数菌株都产生了多重耐药谱。研究结果为奶牛场乳源总菌群、金葡菌耐药性情况及科学用药提供试验数据。     

中西兽医结合治疗奶牛乳腺炎

<正>奶牛乳腺炎为奶牛养殖产业中的常见多发病,遍布全球奶牛养殖生产中。尤其是隐性型乳腺炎的发病率高达50%~60%,是临床型乳腺炎的3~4倍,带来的经济损失甚为惨重。但是,隐性型乳腺炎没有典型临床症状,常规使用抗生素、磺胺类药物,易产生耐药性,药物残留,可能影响消费者的健康。1隐性型乳腺炎隐性型乳腺炎一般不显示临床症状,必须借助特殊诊断才能检测,包括乳房及乳汁的病理变化。日常诊断可采用乳中细胞数     

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础.     

猪源结肠弯曲菌分离鉴定及细胞致死性膨胀毒素三重PCR分子检测

为了探明河南省及周边地区猪源结肠弯曲菌病(campylobacteriosis)的流行情况,本研究对从省内外的猪场和屠宰场采集的猪结肠及粪便样品,进行了病原菌的初步分离培养鉴定。对结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)A、B、C型毒素基因进行了单一PCR检测与扩增,在此基础上建立了结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素A、B、C型三重PCR检测方法。该三重PCR方法可同时扩增出结肠弯曲菌A、B、C毒素型基因,具有较好的特异性。从97份猪结肠样品中分离128株细菌,经16SrRNA基因扩增和结肠弯曲菌特异性引物PCR扩增,确定12株为结肠弯曲菌。本研究为猪源结肠弯曲菌的分离鉴定及结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素A、B、C型毒素基因扩增提供基础,可用于猪源结肠弯曲菌的鉴定及毒素鉴定、食品安全检测与监测等。     

奶牛乳房炎源性产色葡萄球菌的肠毒素基因检测

前期流行病学调查结果显示,凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)是引起我国奶牛乳房炎的主要致病菌之一,而产色葡萄球菌分离率最高的一种CNS。为探明奶牛乳房炎源性产色葡萄球菌肠毒素基因的分布特征,本试验采用PCR方法,对来源于我国11个省份20个奶牛场临床乳房炎奶样中分离鉴定的36株产色葡萄球菌进行9种肠毒素基因的检测,同时对生物被膜的产生能力及生物被膜相关调控基因(ica A、ica D和bap)进行检测。结果显示,在36株产色葡萄球菌中,33株携带至少一种肠毒素基因,占比92%;18株携带两种及以上肠毒素基因,占比50%。检出率较高的肠毒素基因依次为seh(50%)、sei(47%)、sea(36%)和sec(25%)。生物被膜检测结果显示,29株产色葡萄球菌具有生物被膜产生能力,占比81%;此外,36株产色葡萄球菌中,19株携带生物被膜相关调控基因(53%),以ica D基因为主。在奶牛乳房炎源性产色葡萄球菌中,肠毒素基因的高检出率显示其具有较强的乳房炎致病潜力,同时可对奶制品安全生产造成隐患。产色葡萄球菌较强的生物被膜产生能力能够使其对抗生素的耐药性增强,从而降低乳房炎的治疗效果。     

金黄色葡萄球菌表面蛋白A对奶牛乳腺上皮细胞的黏附作用

本试验拟探究金黄色葡萄球菌(金葡菌)表面蛋白A(Staphylococcus aureus surface protein A,SasA)编码基因在奶牛乳源金葡菌中是否具有普遍性及同源性,并结合蛋白结构组成研究SasA对奶牛乳腺上皮细胞的黏附作用.试验前期从中国北方5个荷斯坦牛场无菌条件下分离纯化了73株奶牛乳源金黄色...     

乳房炎奶牛金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及PFGE分型研究

作者针对临床及亚临床乳房炎奶牛乳汁中金黄色葡萄球菌分离株的毒素基因进行检测和脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型,比较2种类型乳房炎金黄色葡萄球菌分离株的差异.无菌法采集奶样,采用国际标准方法从中分离金黄色葡萄球菌,用多重PCR方法扩增nuc基因和mecA基因以确证金黄色葡萄球菌(SA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA).进一步用PCR方法检测SA的各种毒素基因(SEs、ETs、TSST 1和PVL基因等).利用限制性内切酶Sma Ⅰ对SA基因组DNA进行酶切和PFGE分析,最后利用BioNumerics软件进行聚类分析.结果:19.3％(23/119)的临床乳房炎奶样和14.8％(26/176)的亚临床乳房炎奶样确定为金黄色葡萄球菌阳性样品,分别从中分离鉴定出43株和26株金黄色葡萄球菌,其中临床乳房炎分离株中有5株为mecA基因阳性.临床乳房炎奶牛奶样中检测到SA的SEA、SEB、SED、SEJ和PVL毒素基因,检出率分别为3.8％(1株)、11.5％(3株)、19.2％(5株)、7.7％(2株)和31.2％(10株);亚临床乳房炎奶牛乳样中仅检测到SA的SEA和PVL毒力基因,检出率分别为7.0％(3株)和84.1％(37株).表明临床与亚临床乳房炎奶牛乳汁中SA菌株携带的毒素基因不一样,SEs可能是临床乳房炎菌株的重要致病基因,PVL可能是亚临床乳房炎菌株的重要致病基因.69株SA使用Sma Ⅰ酶切分型后,可分为7个大簇、50个基因型,来源相同的SA分型后大部分位于同一簇内.临床乳房炎奶牛乳汁中检测到MRSA菌株,PVL基因在亚临床乳房炎中的检出率为临床乳房炎的2.7倍.PFGE方法能较好的区分临床乳房炎和亚临床乳房炎的SA分离菌株.     

TRAPPC9基因对奶牛金葡菌乳房炎抗性性状的遗传效应

旨在分析奶牛金黄色葡萄球菌(金葡菌)抗性候选基因TRAPPC9的遗传效应。本研究利用中国北方地区6个牛场517头具有完整DHI、年龄及胎次记录的中国荷斯坦牛的生产数据,使用Multiplex SnaPshot微测序技术分析TRAPPC9基因4个SNPs的基因型,利用特异性PCR技术检测牛只感染金葡菌情况,同时测定血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17、NF-κB等细胞因子的含量。在此基础上,利用GLM模型最小二乘法分析TRAPPC9基因4个SNPs对奶牛金葡菌乳房炎抗性的遗传效应。结果表明:IL-17、TNF-α和IFN-γ可作为有效的乳房炎参考指标。对于金葡菌阴性牛,TRAPPC9基因SNP4(C2477531T)对SCS有极显著影响(P0.01);对于金葡菌阳性牛,该SNP对IL-17有极显著效应(P0.01)。TRAPPC9基因可作为中国荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性分子标记之一。     

四川部分地区山羊腹泻病主要病原菌的分离鉴定及耐药性检测

为了解四川部分地区山羊细菌性腹泻的主要病原菌及其对抗菌药物的敏感性,试验采用产肠毒素大肠杆菌K99基因、沙门氏杆菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因和奇异变形杆菌ureR基因的特异性引物,以山羊粪便样本提取的总DNA为模板,采用四重PCR方法检测,并对检出的阳性样本进行细菌的分离鉴定,同时采用药敏纸片法检测分离菌对18种抗菌药物的敏感性。结果表明:在226份粪便样本中产肠毒素大肠杆菌的PCR阳性检出率为55.3%(125/226),沙门氏杆菌的PCR阳性检出率为18.6%(42/226),志贺氏菌的PCR阳性检出率为29.2%(66/226),奇异变形杆菌的PCR阳性检出率为15.9%(36/226),同时检出两种和两种以上病原菌的阳性检出率为29.6%(67/226)。从226份粪便样本中分离到产肠毒素大肠杆菌104株,分离率为46.0%(104/226);沙门氏杆菌32株,分离率为14.2%(32/226);志贺氏菌54株,分离率为23.9%(54/226);奇异变形杆菌23株,分离率为10.2%(23/226);4种病原菌的PCR阳性检出率明显高于分离率。4种病原菌对头孢噻肟、大观霉素、丁胺卡那霉素、头孢拉定4种抗生素高度敏感,而对其余14种抗菌药物均呈不同程度的耐药。说明四川部分地区山羊粪便中4种病原菌的带菌率较高,是引起山羊腹泻的重要病原菌。