全悬浮培养LMH细胞制备FAdV-4灭活疫苗的研究

通过对LMH细胞进行驯化,获得一株可全悬浮培养的LMH细胞,命名为LMH-S。此细胞可适应无血清、高密度悬浮培养,以初始细胞密度0.5×10⁶/mL～1×10⁶/mL接种,细胞密度最高达6×10⁶/mL。研究确定生物反应器悬浮培养LMH-S细胞制备FAdV-4抗原的最优参数为：接毒时细胞密度2×10⁶/mL～3×10⁶/mL、接毒量0.1MOI～1MOI、接毒后48 h～72 h收毒,所获抗原病毒含量不低于10^9.25TCID₅₀/mL。试验鸡分别免疫0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL疫苗,攻毒保护率分别为9/10、10/10、10/10、10/10,表明疫苗有效性良好。本试验成功建立了LMH全悬浮培养细胞株,确定了FAdV-4抗原的生物反应器悬浮培养工艺,验证了悬浮培养抗原的免疫原性,为高效FAdV-4灭活疫苗的研制奠定了基础。     

无血清悬浮培养BHK21细胞增殖伪狂犬病毒的参数研究

旨在筛选适合生物反应器悬浮培养BHK21细胞的无血清培养基,并利用该技术培养伪狂犬病毒。通过筛选市售的无血清培养基,以细胞形态、细胞活率和增殖倍数作为驯化指标,对BHK21细胞进行无血清驯化;对使用10 L和40 L生物反应器无血清悬浮培养BHK21细胞的参数进行研究;同时利用筛选的无血清培养基和悬浮细胞进行伪狂犬病毒增殖测试。结果表明,市售培养基Ⅰ符合筛选要求,其培养的细胞形态比较均一,结团少,细胞生长2 d的增殖倍数为3.5倍,细胞活率在95%以上;生物反应器悬浮培养BHK21细胞的最适参数为转速80 r/min、pH值7.2、DO 60%;利用该工艺技术培养伪狂犬病毒,当接种细胞密度为6×10⁶ cells/mL,接毒剂量为0.3%时,48 h收获的病毒液滴度可达10^9.5 TCID₅₀/mL。该试验实现了伪狂犬病毒的无血清悬浮生产,为其生产工艺的优化提供了可能。     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID₅₀)为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^7.0 TCID₅₀/mL免疫怀孕75～90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明：猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10⁶ 个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10⁶ 个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量...     

一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。     

ST贴壁细胞悬浮驯化及应用

为将ST贴壁细胞通过自主驯化,使其能在ST-S细胞无血清培养基中悬浮生长且能稳定传代,在摇瓶中实现高密度生长,并应用于猪伪狂犬病毒(PRV)悬浮培养,经ST-A低血清培养基适应培养,对一株贴壁的ST细胞进行了无血清的全悬浮驯化,并将PRV在悬浮细胞中连续盲传培养。结果显示:ST悬浮细胞能在无血清培养基中传代,培养48 h至第3代后,所能达到的最终细胞密度为3.00×10^(6 )cells/mL以上;PRV连续培养至第5代,毒价可达到109.0 TCID50/mL。结果表明,用专用培养基可使ST贴壁细胞实现悬浮驯化,并可应用于PRV悬浮培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高PRV增殖效率奠定了技术基础。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

犬细小病毒悬浮培养工艺研究

研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示：生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×10¹⁰个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×10¹¹个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2～7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为10^7.43 TCID50/mL。     

BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究

为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^-3接种于密度为2×10⁶ cells·mL^-1的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5 μg·mL^-1时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。     

BHK-21悬浮细胞流加培养的研究

试验旨在研究流加培养基中不同营养成分、初始接种密度、流加起始时间对BHK-21悬浮细胞流加培养的影响。结果表明,流加浓缩包中的氨基酸对促进细胞生长有明显影响,而无血清培养基添加成分不仅促进细胞生长,且对细胞活力的维持起着较为重要的作用。初始接种密度为3×10⁵～6×10⁵ m/L,培养至48 h开始流加一定量的浓缩液,流加培养效果较好。另外,在已优化的条件下进行流加培养,未出现细胞大量凋亡现象。     

Susceptibility of various ceil culture systems to pseudorabies virus

A comparative study was carried out to determine the susceptibility of five different cell lines to pseudorabies virus (PRV), a herpes virus of pigs. The cell systems tested were swine testicle (ST), mink lung (ML), equine dermal (ED), porcine kidney (PK₁₅), and bovine turbinate (BT) cells. Virus titers obtained were 10^4.88, 10^4.38, 10^3.75, 10^2.63, and 10^0.25 for ML, ST, PK₁₅, BT and ED cells, respectively indicating that ML, ST, and PK₁₅ are optimal cell lines for the growth of PRV whereas BT and ED are not very sensitive.     

多种因素对小鼠卵母细胞体外受精效果影响的分析

为了探讨不同精子获能时间,精卵孵育时间,精子密度以及颗粒细胞对小鼠卵母细胞体外受精的影响,从而达到对卵母细胞体外受精体系优化的目的。比较了精子获能时间分别为40 min、60 min、80 min试验组的受精卵卵裂率。结果表明,带颗粒细胞卵母细胞(COCs)在三个试验组中卵裂率无显著差异,不带颗粒细胞卵母细胞(NO)在精子获能时间为60 min时卵裂率最高;比较了精卵孵育时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h试验组的受精卵卵裂率,结果显示COCs精卵孵育时间2 h试验组的效果最好,NO孵育时间为6 h试验组的效果最好;比较了精子密度分别为3×10⁵/mL,3×10⁶/mL,3×10⁷/mL试验组受精卵卵裂率,结果显示COCs和NO均为3×10⁶/mL试验组卵裂效果最好;比较COCs和NO的受精卵卵裂率,结果显示COCs与NO之间存在显著差异(P<0.05),裸卵卵裂效果显著优于颗粒细胞卵裂效果。试验结果表明,在卵母细胞体外受精过程中,精子获能时间60 min,精子密度为3×10⁶/mL,精卵孵育6 h,培养24 h后卵裂率最高。     

猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究

本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用10^3.5 TCID₅₀/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达10^3.5 TCID₅₀/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为10^4.5 TCID₅₀/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。     

微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒的工艺研究

从细胞接种密度、病毒接毒量、培养基三个方面进行研究和优化,并进行放大培养,建立了猪瘟病毒的微载体悬浮培养工艺:细胞接种密度为每个微载体15个细胞,病毒接毒量0.05 MOI,采用DMEM/F12培养基进行培养和细胞消化瓶批式消化分散细胞,培养的细胞可以完成生物反应器10 L到50 L的放大,培养的病毒含量达到7.6 l...     

大肠杆菌噬菌体BP16对鸡大肠杆菌病的防治效果

【目的】 探究大肠杆菌噬菌体BP16对O2血清型禽致病性大肠杆菌感染引起的鸡大肠杆菌病的防治效果, 以及噬菌体BP16的最佳治疗剂量。【方法】 将O2血清型禽致病性大肠杆菌新鲜培养物稀释成5×10¹⁰、5×10⁹、5×10⁸、5×10⁷和5×10⁶ CFU/mL 5个浓度梯度, 以测定禽致病性大肠杆菌的半数致死量(LD₅₀), 确定其感染剂量; 选取常用的对革兰阴性菌有抑菌或杀菌作用的药敏纸片进行药敏试验, 筛选出阳性对照药物; 经无菌试验和安全性试验确定噬菌体裂解液的无菌性及安全性, 用于后续试验。将80只雏鸡随机分为5个试验组与3个对照组, 试验组在雏鸡攻毒前后不同时间腹腔注射大肠杆菌噬菌体BP16, 3个对照组分别腹腔注射氟苯尼考、大肠杆菌菌液、生理盐水, 其余条件一致, 连续饲养7 d, 记录雏鸡的死亡率, 评价大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌人工感染试验鸡的防治效果。【结果】 O2血清型大肠杆菌的LD₅₀为1.5×10⁸ CFU/mL, 筛选出氟苯尼考作为阳性对照药物, 噬菌体裂解液中无菌, 噬菌体悬液对雏鸡安全, 可用于后续防治试验。雏鸡感染大肠杆菌前6 h使用噬菌体能有效预防大肠杆菌病, 在感染同时至感染后6 h内使用噬菌体, 能有效治疗大肠杆菌病, 且噬菌体治疗效果优于氟苯尼考; 当大肠杆菌攻毒剂量为1.5×10⁸ CFU时, 噬菌体剂量为1.5×10⁹ PFU时治疗效果为最佳。【结论】 大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌病具有防治作用, 本研究为进一步应用噬菌体防治大肠杆菌病及开发大肠杆菌噬菌体制剂提供了科学依据。