玉米转录因子Zmhdz6的表达模式分析及互作功能蛋白预测

利用RT-PCR方法从玉米基因组中克隆到GRMZM2G056600(Zmhdz6)转录因子的cDNA序列长786 bp,编码261个氨基酸,分子质量为28.46 kD。二级结构显示,编码的蛋白主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。亚细胞定位预测显示,Zmhdz6蛋白定位于细胞核。进化树和motifs分析发现,Zmhdz6基因属于HD-Zip-I家族成员且与高粱同源达到99%,单子叶植物亚群含有7个重要的motifs。Zmhdz6蛋白互作预测,发现互作的基因主要参与逆境胁迫、信号传导和植物生长发育过程。荧光定量结果显示,Zmhdz6基因在雌穗和雄穗中高度表达,NaCl、PEG胁迫和外源ABA诱导时均上调表达。结果说明Zmhdz6基因可能参与玉米逆境胁迫的应答和信号传导路径。     

小麦多蛋白桥梁因子基因 TaMBF1c的克隆与表达分析

多蛋白桥梁因子(multiprotein bridging factor 1,MBF1)是一类广泛存在于植物中的转录共激活因子,在植物生长发育和逆境响应过程中发挥重要作用。为进一步了解该蛋白的功能,利用同源克隆法从小麦中获得 MBF1基因,根据其染色体位置分别命名为 TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D,通过生物信息学方法分析其蛋白序列特征、蛋白三级结构及顺式作用元件,并利用RT-qPCR技术分析其组织表达特异性以及干旱、热胁迫响应模式。序列分析表明,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D分别含有456、471和465 bp的开放阅读框;三维结构预测发现,TaMBF1c-A、TaMBF1c-B和TaMBF1c-D在N端和C端分别含有MBF1结构域和4个α螺旋组成的helix-turn-helix结构域;系统进化分析结果表明, TaMBF1c基因与二粒小麦(Triticum dicoccum)的亲缘关系最近。顺式作用元件分析发现, TaMBF1c-A、 TaMBF1c-B和 TaMBF1c-D启动子区都含有干旱响应元件(MBS element/MYB element)和热响应元件(HSE element)。RT-qPCR分析显示, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B基因在叶片中特异性表达, TaMBF1c-D只在根部特异性表达;在干旱胁迫条件下, TaMBF1c在干旱敏感小麦品种中表达量较高,其表达量是 TaMBF1c在耐旱小麦品种中表达量的280倍, TaMBF1c在干旱信号途径中起负调控作用。在热胁迫条件下, TaMBF1c-A和 TaMBF1c-B在热敏感与耐热小麦品种中上调表达,而 TaMBF1c-D仅在热敏感小麦品种中上调表达,明显高于耐热小麦品种。     

花花柴KcPIP2;1基因的克隆及表达分析

根据一个从差减杂交文库中获得的EST序列设计引物,采用3′RACE技术从花花柴（Karelinia caspia）中克隆了编码质膜内在蛋白的基因PIP2;1,命名为KcPIP2;1,并运用定量PCR技术对KcPIP2;1的表达模式进行分析。研究结果表明,KcPIP2;1基因全长1 095 bp,包含855 bp的开放阅读框,编码284个氨基酸。Blast分析显示,KcPIP2;1与甜叶菊、毛果杨、胡桃、橡胶树和蓖麻的水通道蛋白的同源性分别为88％、87％、87％、86％和86％。多序列比对及进化树分析表明,KcPIP2;1属于PIP2亚家族。表达分析结果显示;KcPIP2;1在叶组织中的表达量最高;在NaCl胁迫下,2 h内KcPIP2;1的表达量上调至最高水平,之后逐渐降低,约48 h后又升至较高水平。这些结果表明,KcPIP2;1可能与花花柴耐盐机制相关。     

玉米V-ATPase B亚基基因(ZmVHA-B)的克隆及其表达分析

根据玉米基因组数据MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)已经公布的玉米VHA-B(V-ATPase subunit B)基因的mRNA序列(AY104180),从干旱处理玉米材料CN165的花丝中利用RT-PCR技术获得VHA-B基因的编码序列,并进行了序列分析和Northern杂交分析。结果表明：VHA-B基因编码487个氨基酸,含有1个保守的ATP结合位点,其编码的蛋白分子量为54.09 kD,等电点为4.99。氨基酸同源性分析表明：V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基。Northern杂交结果表明：在干旱处理下,B亚基存在两个不同的转录本,它们对干旱的响应不同;在盐胁迫下,同样也存在两个转录本,它们都对盐胁迫做出了响应;在冷处理下,仅存在1个转录本,且它的表达较强,仅仅在6 h有一些微小地反复;在ABA处理下,也仅存在1个转录本,处理1 h后表达明显上调,此后一直保持较高的表达水平。玉米VHA-B基因对花期干旱有响应,但在花丝和雌穗中的表达响应方式不同,在花丝中干旱诱导表达明显,而在雌穗中存在表达没有明显差异的两个转录本。     

玉米ZmGAPDH2基因的克隆及表达特性分析

研究通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR和同源克隆技术从玉米叶片中克隆出GAPDH2基因的全长cDNA序列。采用qRT-PCR分析两个玉米品种登海605和蠡玉35幼苗叶片中GAPDH2基因在非生物胁迫和ABA 处理下的表达特性,利用二维凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI-TOF）,对登海605和蠡玉35幼苗在干旱胁迫下叶片中的GAPDH蛋白表达水平进行分析。结果表明,ZmGAPDH2基因开放阅读框（ORF）全长1 014 bp,编码337个氨基酸。ZmGAPDH2蛋白分子量为36.53 kDa,属于亲水性蛋白。生物信息分析发现,玉米 ZmGAPDH2 蛋白和单子叶植物小米 GAPDH2 蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94.66%。qRT-PCR分析表明,ZmGAPDH2在登海605和蠡玉35叶片中均能被ABA和PEG处理诱导表达,登海605在NaCl和蠡玉35幼苗在低温处理下其表达量均有所下降。干旱对登海605和蠡玉35幼苗叶片中ZmGAPDH2蛋白表达量也有影响。     

盐胁迫下玉米WRKY转录因子生信及表达分析

WRKY是一类在逆境胁迫响应中起重要调控作用的转录因子。基于盐胁迫下的玉米转录组数据,确定了16个差异表达的WRKY基因家族成员。利用生物信息学方法对各成员理化性质、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的相对表达量进行分析验证。结果表明,16个差异表达的WRKY基因家族成员主要分布在玉米的7条染色体上,各成员之间理化性质存在差异。qRT-PCR 验证结果表明,不同基因家族成员对盐胁迫的敏感程度不同,对胁迫处理时间的响应也有所不同。ZmWRKY106、ZmWRKY108、ZmWRKY91、ZmWRKY27在盐胁迫后24 h内均未参与表达,经盐胁迫处理6 h后ZmWRKY63表达量达到最高。各家族成员对盐胁迫的响应及敏感程度不同,可能与各成员间理化性质和结构的差异以及所含的顺式作用元件、内含子和motif类型有关。     

巴西橡胶树乳管细胞HbWRKY1基因克隆及表达分析

采用PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆了WRKY转录因子家族的一个成员HbWRKY1。该基因全长为1755 bp,含有1个1440 bp阅读框,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,HbWRKY1含有2个WRKY结构域和C2H2锌指结构基序,与蓖麻、杨树、葡萄、黄瓜、拟南芥的WRKY成员的氨基酸序列同源性分别为64.14%、60.04%、42.54%、40.61%和35.4%,属于Ⅰ类WRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,割胶和乙烯显著上调HbWRKY1基因的表达,但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响,表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。     

生长素响应及转运信号在玉米不同节位腋芽发育过程中的分布模式分析

玉米多穗影响玉米的产量和品质,受环境因素及基因型等诸多因素调控。生长素作为一种重要的植物发育调控因子,其代谢和转运在植物的器官形成和分化中均发挥重要作用。借助DR5rev::mRFPer和pZmPIN1a::ZmPIN1a::YFP的转基因植株,通过分析红色荧光蛋白标记的生长素响应信号和黄色荧光蛋白标记的生长素转运蛋白PIN1a的分布模式发现,在植株发育早期,不同节位上的腋芽处于同一发育时期,未发生成花转变,生长素响应信号和生长素转运蛋白的分布模式是一致的,均匀分布在整个腋芽原基中。随着植株的生长,不同节位上的腋芽发育开始出现不同步,生长素响应信号和生长素转运蛋白的分布模式产生明显差异,位置越靠上的腋芽生长素响应信号越强,极性转运越活跃。研究结果暗示,生长素局部合成和极性转运在玉米腋芽发育过程中均发挥作用。     

巴西橡胶树HbMADS4的克隆及原核表达分析

为了探讨巴西橡胶树自根幼态无性系高产的分子机制,通过抑制缩减杂交获得了在巴西橡胶树自根幼态无性系和老态无性系胶乳中差异表达的基因片段。为进一步鉴定差异表达基因的功能,对相关基因进行克隆。通过RACE方法克隆一个新的橡胶树MADS-box转录因子基因（命名为HbMADS4）, HbMADS4全长984 bp,含有633 bp的阅读框,编码230个氨基酸。推测HbMADS4蛋白分子量为23.71 ku,等电点为7.61,在N端含有典型的MADS-box结构域。构建HbMADS4原核表达载体pHbMADS4,将其转化E. coli, 经优化条件后,在20 ℃,0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下,获得HbMADS4融合蛋白。HbMADS4的克隆和HbMADS4融合蛋白的获得为深入研究HbMADS4的功能奠定基础。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现,小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达,并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32,但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析,然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作,并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料,利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明, TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近,且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明,TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因,发现该基因沉默后,小麦植株对缺钾胁迫更为敏感,植株生长受到抑制,干重显著降低,丙二醛(MDA)含量显著提高;缺钾胁迫处理下,沉默 TaHIPP32基因的植株中, TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制,且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低,说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

玉米ZmSAMS1基因在盐、干旱等逆境胁迫下的表达分析

采用Northern杂交对玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ZmSAMS1在玉米幼苗期根、茎、叶中的表达及盐胁迫下外施不同甲基供体试剂处理下的表达进行分析。结果表明,ZmSAMS1在根、茎中均有表达,叶中信号较弱;盐胁迫外施甜菜碱、氯化胆碱、叶酸条件下该基因表达量不同,推测ZmSAMS1可能参与盐胁迫下玉米根茎木质化和栓质化过程。荧光实时定量PCR分析表明,ZmSAMS1在干旱和高温胁迫下表达量上调幅度较大,在盐、低温和ABA胁迫下表达量上调或下调幅度较小,揭示ZmSAMS1可能参与干旱、高温等逆境胁迫应答。     

玉米逆境胁迫响应基因ZmbZIP15的克隆与抗旱功能分析

从转录组数据中筛选到27个参与干旱-复水胁迫响应的bZIP基因,构建共表达网络图。结果发现,ZmbZIP15处于核心节点位置,该基因位于第5号染色体,编码176个氨基酸,包含高度保守的bZIP结构域,属于亲水性蛋白。蛋白进化树分析发现,该蛋白与芒草、高粱的亲缘关系最近,与大麦、小麦的亲缘关系最远。ZmbZIP15基因ATG上游2 K启动子的顺式元件分析,发现含有多个参与调控脱落酸、低温和干旱的结合元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,ZmbZIP15是组成型表达基因,在雌穗高表达,幼茎的表达量最低。干旱、高温、盐、氮胁迫处理下,该基因的表达量显著上调,说明ZmbZIP15基因积极参与并调控非生物胁迫途径。过表达ZmbZIP15转基因拟南芥抗旱性检测分析,发现干旱胁迫处理下过表达ZmbZIP15基因能够提高拟南芥幼苗的抗旱性。亚细胞定位显示,该基因编码的蛋白定位于细胞核。     

玉米ZmGly基因不同非生物胁迫下的表达特性与ZmGly1基因的克隆

植物乙二醛酶系统在清除非生物胁迫产生的甲基乙二醛(MG)中起着重要作用。玉米基因组中有3个编码乙二醛酶基因(ZmGly1、ZmGly2和ZmGly3)。利用qRT-PCR技术解析ZmGly在玉米不同组织器官和不同胁迫条件下的表达差异,克隆MG降解关键基因ZmGly1。结果表明,ZmGly1和ZmGly2在叶片中的相对表达量较高,ZmGly3在茎中的表达量较高。除涝害处理下表达量降低外,ZmGly1和ZmGly3叶片中的相对表达量在干旱、盐、高温和低温处理下均随处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势;ZmGly2在所有胁迫处理下均呈现先升高后降低的趋势。测序结果表明,克隆到的ZmGly1片段大小及序列正确。ZmGly在不同器官中的表达不仅具有特异性,而且对不同非生物逆境胁迫的响应各异。     

玉米Ⅰ型二酰基转移酶基因(DGAT1)的生物信息学分析及其在非生物胁迫下的表达研究

对玉米中的两个I型DGAT基因ZmDGAT1.1和ZmDGAT1.2进行生物信息学分析。结果表明,两个玉米DGAT1基因编码的蛋白均属于膜结合的酰基转移酶类MBOAT家族,均含有多个跨膜结构域以及保守的底物结合和催化功能区。两个玉米DGAT1基因的不同组织和发育阶段表达分析显示,两者在胚乳发育期表现出高水平表达;在种子发育期表达模式完全不同,ZmDGAT1.2在种子发育既油脂合成的早期表达水平较高,ZmDGAT1.1在种子发育和油脂合成的后期表达水平更高。多种非生物胁迫处理条件下的qRT-PCR检测结果表明,两个DGAT1基因对多种非生物胁迫的响应模式也有明显差异,说明其在参与逆境胁迫响应方面发挥着不同的作用。     

大麦ARF基因家族的全基因组分析

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)基因家族是植物特有的转录因子家族,在调控植物生长发育过程中起到重要作用。而关于大麦ARF基因家族全基因组分析的研究尚未见报道。为进一步探讨大麦ARF基因的功能,以公布的大麦栽培品种Morex的基因组数据为基础,采用生物信息学方法鉴定了大麦ARF基因,并对其结构、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化树及表达谱进行了分析。结果表明,共鉴定出了17个大麦ARF基因,除4号染色体外,其余6条染色体上均有分布,片段复制事件是大麦ARF基因家族的主要扩张方式;HvARF蛋白均具有保守的B3结构域和Auxin_resp结构域,而Aux/IAA结构域仅存在于12个HvARF蛋白中,且不同蛋白所含该结构域1~2个不等;不同植物中ARF基因在功能上具有保守性;不同组织器官中HvARF基因的表达存在明显的差异。     

玉米生长调节因子(GRF)家族的全基因组鉴定及在非生物胁迫下的表达研究

以拟南芥作为种子序列进行Blastp序列比对,共鉴定15个ZmGRFs基因,对其理化性质、系统进化关系等在非生物胁迫下的表达进行分析。根据系统发育树分析表明,ZmGRFs基因与单子叶植物水稻亲缘关系较近,15个ZmGRFs基因分别定位在1、2、4、5、6、7、9、10号染色体上且各个基因之间高度同源,每个亚族之间基因结构及保守基序均相对保守。ZmGRFs蛋白二级结构均以α-螺旋和无规卷曲为主。根据磷酸化位点预测分析表明,除ZmGRF6和ZmGRF9不含酪氨酸外,其他ZmGRFs蛋白均含有潜在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点且各蛋白之间的潜在的磷酸化位点数目差异较大。根据转录组数据分析表明,ZmGRF4和ZmGRF13基因在NaHCO3上调表达,同时发现热、盐和干旱胁迫下ZmGRF4和ZmGRF13基因表达较高,冷胁迫下ZmGRF1/3/4/15基因表达较高。根据不同组织部位表达谱分析显示,ZmGRF4和ZmGRF13在各个部位表达均较高。     

巴西橡胶树HbCZF1的原核表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HMGR)是天然橡胶生物合成途径中的关键酶之一,在先前的研究中本课题组已克隆了与Hmgr1启动子互作的转录因子基因HbCZF1。本研究在此基础上,构建了HbCZF1的原核表达载体PET-28a(+)-HbCZF1,将其转化E.coli Rosetta(DE3)菌株。经优化条件后,在20℃,0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下,获得了分子量约47 ku的HbCZF1融合蛋白。