基于代谢组解析大黄鱼对低温和饥饿胁迫的适应机制

为探讨大黄鱼Larimichthys crocea对低温和饥饿氧化损伤的响应机制,本实验将体质量为（21.38±2.46）g的大黄鱼在低温（8°C）或/和禁食条件下饲养。实验组可分为4个处理组：对照组（C组）、低温组（CC组）、饥饿组（F组）和饥饿+低温组（CF组）,每组3个平行。低温和饥饿胁迫30 d后,计算成活率;采取肝脏样本,进行组织学观察,并利用化学荧光法和LC-MS非靶向代谢组学技术分析处理组间活性氧（ROS）和代谢产物的差异。结果表明,与C组相比,CC组、F组和CF组的成活率显著降低,而ROS含量显著升高（P < 0.05）,且肝细胞均出现不同程度的空泡和核萎缩现象,表明低温和饥饿胁迫对大黄鱼产生了氧化损伤。大黄鱼低温应激后,从CC vs. C和CF vs. F中分别筛选出84种和154种差异代谢物,有5种重要的重叠代谢途径：甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成和自噬等,表明细胞膜流动性和自噬在大黄鱼低温适应过程中发挥重要作用。大黄鱼饥饿应激后,从F vs. C和CF vs. CC中分别筛选出184种和50种差异代谢物,有4种重要的重叠代谢途径：甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、ABC运输体和自噬等,表明能量代谢和自噬在大黄鱼饥饿过程中发挥重要作用。从CF vs. C中筛选出差异代谢物126种,主要富集在糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、甘油磷脂代谢、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢、FoxO信号通路、自噬和谷胱甘肽代谢等,表明细胞膜流动性、能量代谢、自噬和抗氧化系统在大黄鱼适应低温和饥饿联合胁迫过程中发挥重要作用。本文结果为深入研究低温及其诱导的饥饿对大黄鱼生理功能的影响提供科学依据。     

不同低温胁迫时间对大黄鱼血清生化指标的影响

研究了岱衢族大黄鱼在8.5 ℃低温胁迫下不同持续时间(0、12、24、36 h)血清生化指标的变化.试验结果表明,随着低温胁迫持续时间的延长,大黄鱼血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷酰转肽酶和乳酸脱氢酶活性升高,而碱性磷酸酶和Ca2+相比于对照组呈下降趋势;血清总蛋白、白蛋白、胆固醇和甘油三酯浓度先降低后升高,而铁蛋白、肌酐、Na+和Cl-浓度先升高后降低,肌酸激酶同工酶和K+呈波动状变化.当低温胁迫持续24 h后,试验鱼开始进入低温适应阶段.     

基于转录组解析铜驯化对低温胁迫下大黄鱼氧化损伤的影响

为探讨铜驯化对低温胁迫下大黄鱼(Larimichthys crocea)氧化损伤和基因表达水平的影响, 本研究将体重为 (48.92±3.62) g 的大黄鱼暴露在铜浓度为 0 和 10 μg/L 的水体中 14 d, 再暴露在温度为 8 ℃的水体中 24 h。结果显示, 低温胁迫显著增加了活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)含量。尽管铜驯化对 ROS 和 LPO 含量不产生影响, 但铜驯化显著增加了低温胁迫下大黄鱼 ROS 和 LPO 含量, 表明铜驯化加剧了低温胁迫对大黄鱼的氧化损伤。从铜驯化相对对照组、低温胁迫相对对照组和铜驯化+低温胁迫相对低温胁迫中分别筛选到 2288 个、1425 个和 1382 个差异基因。GO 和 KEGG 分析发现差异基因主要富集在与脂肪酸代谢、糖类有氧代谢、谷胱甘肽代谢、内质网应激、自噬和凋亡等相关的通路中。聚类分析表明, 低温胁迫上调了不饱和脂肪酸合成、内质网应激、自噬和凋亡等相关通路中的大部分基因表达, 而铜驯化则对低温胁迫下大黄鱼的这些基因表达调控产生了拮抗效应, 表明铜驯化通过抑制不饱和脂肪酸合成、内质网应激、自噬和凋亡来降低大黄鱼的低温胁迫耐受性。研究结果为深入研究铜污染物对大黄鱼低温胁迫耐受性的影响及其分子机制提供科学依据。     

大黄鱼slitrk3基因启动子克隆及转录调控分析

神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制,可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析,并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件,采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示,Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性;大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBPα和C/EBPβ等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示,大黄鱼slitrk3基因启动子区域的-1 970—-1 614 bp、-1 210—-667 bp存在正调控元件,-1 614—-1 210 bp、-667—-376 bp、-376—-147bp存在负调控元件,推测-147—+16 bp为核心启动子。     

大黄鱼冷诱导结合蛋白(CIRP)基因cDNA克隆及低温胁迫对其时空表达的影响

为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性低温胁迫中(12℃缓降至6℃),皮肤和肌肉中CIRP基因的表达量呈随温度降低而升高的趋势,6℃时表达量分别为12℃时的11.56倍和9.03倍;鳃、脑和心脏中CIRP基因表达量均呈先显著上升后显著下降的趋势,其峰值均出现在8℃时,表达量分别为12℃时的5.07、7.69和2.83倍;肠、肾脏、肝脏和脾脏中的表达量随温度降低而下降,6℃时的表达量最低,与12℃时相比降幅分别为80.0%、65.6%、91.2%、55.6%。急性低温胁迫(由12℃骤降至8℃并胁迫4 h)条件下,鳃、皮肤、脑、肝脏、心脏中CIRP基因表达量均呈先升高后降低的变化,反映了机体对低温胁迫的应激、适应过程;肌肉和肠中的表达量则始终显著低于胁迫前。慢性和急性低温胁迫中各组织CIRP表达量变化的差异提示,大黄鱼机体在低温胁迫响应和适应中有着多种调节机制。研究表明,CIRP基因参与了大黄鱼应对低温胁迫的过程。     

基于转录组分析筛选凡纳滨对虾低温胁迫下的差异表达基因

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是中国主要的对虾养殖品种之一,对低温的耐受性较差,低于18℃就会停止摄食。为了探究凡纳滨对虾耐低温性状相关基因,选用凡纳滨对虾低温胁迫组(18℃)和常温组(24℃)肝胰腺组织为实验材料,进行Illumina HiSeq 2500测序,对测序原始数据进行拼接、注释,以及筛选分析低温胁迫下的差异表达基因。结果显示,测序共获得50921条基因(unigene),平均长度为828 bp, N50为1589 bp,其中28.13%为已知基因。基因差异表达分析共筛选得到243个低温胁迫相关基因,其中89个上调表达, 154个下调表达。功能富集分析发现,差异表达基因多富集在生物结合和催化过程、过氧化物酶、溶酶体、精氨酸和脯氨酸的代谢以及氨基酸的生物合成途径中。进一步根据Q-值共筛选出10个差异表达最显著的基因,其中ATP结合盒B亚家族6转运蛋白基因(ATP-binding cassette sub-family B member 6, ABCB6)、C型凝集素基因(C type lectin)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase, GS)在低温胁迫下均呈下调表达,推测可能参与了凡纳滨对虾低温应答反应。利用Real time RT-PCR验证转录组数据,结果证明基于转录组测序筛选低温胁迫下的差异表达基因是可行的。本研究为揭示凡纳滨对虾耐低温分子调控机制提供了基础数据和理论依据。     

低温速冻处理对养殖大黄鱼冻藏品质的影响

研究了养殖大黄鱼分别用-20℃空气冻结和-65℃低温速冻处理后,在-18℃冻藏过程中肌肉蛋白质生化特性、质构特性以及组织结构的变化情况。结果表明,无论是-20℃空气冻结还是-65℃低温速冻,随着贮藏时间的延长,养殖大黄鱼的盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、硬度均呈下降趋势,pH值先下降后上升。低温速冻处理冻结速率快,组织细胞产生的冰晶小且均匀,细胞形态基本保持完整,对盐溶性蛋白质含量和Ca2+-ATPase活性影响极显著(P0.01),低温速冻更有利于保持养殖大黄鱼的品质。     

铜驯化改善大黄鱼低温耐受性的作用机制

为了探讨铜驯化改善大黄鱼(Larimichthyscrocea)低温耐受性的作用机制,将大黄鱼幼鱼放入含Cu20μg/L的水体中驯化7 d,然后暴露在10℃的水体中6 h和24 h,检测其抗氧化能力、能量代谢和非特异性免疫力指标的变化。结果表明,低温胁迫增加了大黄鱼的活性氧(ROS)含量,加重了肝细胞畸形,表明低温胁迫对机体产生了氧化损伤。与低温胁迫相比,铜驯化+低温胁迫提高了谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、ATP合成酶、琥珀酸脱氢酶、碱性磷酸酶和溶菌酶的活性,增加了谷胱甘肽和ATP含量,降低了ROS、乳酸含量和肝细胞空泡率,表明铜驯化通过改善大黄鱼的抗氧化能力、能量代谢效率和非特异性免疫力来缓解低温胁迫对机体的损伤。结论认为,铜驯化通过产生适应性反应来提高大黄鱼的低温胁迫耐受性,表现了毒物兴奋效应作用。     

高温胁迫下大黄鱼肝脏的蛋白组学

为探究大黄鱼在高温胁迫条件下的蛋白表达情况,实验应用串联质谱标签tandem mass tag (TMT)标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对大黄鱼耐高温组和不耐高温组的肝脏组织进行蛋白组学分析。共鉴定到3 369个蛋白,其中有687个差异表达蛋白,包括281个上调蛋白和406个下调蛋白。用平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)对随机挑选的13个蛋白进行验证,其结果与TMT标记的蛋白组学分析结果一致。随后,通过生物信息学分析发现,高温胁迫对大黄鱼的蛋白质折叠、能量代谢有显著影响,其中热休克蛋白70 (heat shock proteins 70, HSP70)、钙网蛋白(calreticulin, CRT)和葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein, GRP)参与调节蛋白质的正确折叠,丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)参与高温条件下的能量供给。由此推测HSP70、CRT、GRP和PK在大黄鱼应对高温胁迫时发挥着重要的作用。     

高温胁迫下大黄鱼肝脏的蛋白质组学

为探究大黄鱼在高温胁迫条件下的蛋白表达情况,实验应用串联质谱标签tan-dem mass tag(TMT)标记结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对大黄鱼耐高温组和不耐高温组的肝脏组织进行蛋白组学分析.共鉴定到3 369个蛋白,其中有687个差异表达蛋白,包括281个上调蛋白和406个下调蛋白.用平行反应监测...     

Molecular cloning, characterization, and gene expression of the androgen receptor in the large yellow croaker, Larimichthys crocea

Androgens mediate a wide range of physiological responses and developmental processes in vertebrates, involving both reproductive and nonreproductive systems. The activity of androgens is mediated by the androgen receptor (AR), a member of the nuclear receptor superfamily. In this study, an AR gene was cloned from the large yellow croaker (Larimichthys crocea) for the first time. qRT-PCR revealed ubiquitous expression of AR in all adult tissues examined, with higher expression in the gonad and liver of both sexes and highest expression in the blastula stage of embryonic development. Using in situ hybridization, we detected positive signals of AR in the spermatogonium, spermatocyte, spermatid, and spermatozoon during spermatogenesis, in the cytoplasm of all oocytes during oogenesis and in the follicle cells of stage IV oocytes. Our findings support the important role that AR plays in gametogenesis, gonadal development, and the early stages of embryonic development.     

杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶基因克隆及应激下的表达

 利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库, 筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase, PAP)同源片段, 进而克隆获得PAP的cDNA全序列, 命名为HdPAP, 并进行了HdPAP蛋白的结构分析和功能预测, 同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP表达变化。HdPAP基因cDNA全长1 215 bp, 含有1个编码322 个氨基酸的969 bp的开放阅读框。经Blast比对, 与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP氨基酸序列一致性最高, 达59%。通过实时定量PCR检测, HdPAP在检测的杂色鲍各组织中均有表达, 其中在血细胞和肝胰腺的表达量显著高于其他各组织(P<0.05)。高温应激下, 在检测的6个时相中, HdPAP在血细胞、肝胰腺和鳃中均出现不同程度的表达抑制。缺氧应激后, 4 h血细胞中HdPAP显著低于对照组, 24 h恢复到正常水平, 96 h显著高于对照组(P<0.05), 到192 h又恢复到正常水平。副溶血弧菌感染实验中检测到HdPAP在血细胞中同样出现表达抑制现象, 3 h和6 h均检测到感染组HdPAP表达量显著低于对照组(P<0.05)。PAP在高温、缺氧及弧菌感染下显著的表达抑制从转录水平揭示了其作为表达下调的酯酶可能参与胁迫下的生物代谢和免疫反应。

     

大黄鱼耳石锶标志技术

利用六水合氯化锶进行大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼耳石的标记,探讨了锶元素对大黄鱼幼鱼耳石的元素指纹标记效果,分析了锶元素标记对大黄鱼幼鱼生长和存活的影响。结果表明:(1)阶段性倍增饲养水体中锶离子浓度可使标记组个体在特定耳石区段的Sr/Ca比值显著提升,形成与对照组个体和野生个体在该耳石区段Sr/Ca比值的显著差异(P0.01),标记组、对照组和野生个体在该耳石区段的Sr/Ca比值分别为(3.58±1.09)mmol/mol、(1.73±0.08)mmol/mol和(1.09±0.35)mmol/mol。此区段形成的Sr/Ca比值峰值可视作标记组个体的耳石锶元素人工标记。(2)标志组和对照组大黄鱼幼鱼的生长速率和存活率均无显著性差异(P0.05),表明此项标记技术对受标个体的生长和存活状况不会产生显著负面影响,可用作大黄鱼增殖放流鱼苗的规模化标记手段。     

网箱养殖大黄鱼水下声音与行为反应

利用水下声音测量系统(带宽20 Hz~24 k Hz)分别记录了浙江省象山县西沪港和福建省福鼎市沙埕港网箱养殖大黄鱼的水下声音和行为反应,并对声音数据进行频谱分析和声压级(SPL,d B:re 1μPa)计算。结果显示:(1)网箱周围水下声音主要为,自然环境噪声(风、波浪,500 Hz~24 k Hz)、大黄鱼生物噪声(惊扰发声主峰值630 Hz、摄食发声主峰值800 Hz、游泳噪声50~400 Hz、摄食噪声20~2 200 Hz)和人为噪声(船舶噪声50~500 Hz);(2)船舶噪声SPL(约87.68 d B)低于部分石首鱼科听觉阈值(94.9~99.6 d B:re 1μPa),不影响大黄鱼声通讯和摄食行为;(3)网箱内生物噪声声压级强度:惊扰状态摄食状态背景噪声。结果表明,大黄鱼生物噪声频率主峰值和声压级强度与行为反应有关,即行为反应程度越激烈,频率主峰值越低,声压级强度越高。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5’非编码区(UTR)为89 bp,3’UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3?非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5?非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 kD,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明, PmGDH的mRNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P<0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析

为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用,该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp,开放阅读框(ORF)为1 242 bp,3'非编码区(UTR)为584 bp,包括含有30个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸,预测分子量为45.852 kD,理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为鳃组织,在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明,PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调,显著高于对照组(P0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调,并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大,所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。     

杂色鲍同种移植炎症因子1的克隆及其在应激下的表达

同种移植炎症因子AIF-1 (allograft inflammatory factor 1,AIF-1)是一种由干扰素γ诱导的含有EF-hand结构域的钙离子结合蛋白,其功能主要是参与移植排斥、免疫炎症反应、自身炎性和非炎性的损伤等.首次克隆了杂色鲍AIF-1基因cDNA全序列,命名为HdAIF-1,其全长为942 bp,开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸.实时荧光定量PCR结果表明:HdAIF-1在杂色鲍各组织中均有表达,其中在血淋巴和鳃中表达量最高.高温应激下,HdAIF-1在鳃组织中各时相表达均显著上调,并在温度升至31℃时达到最高.而血淋巴和肝胰腺中HdAIF-1在高温应激前4个时相表达无显著差异,到了96 h均显著上调.缺氧应激下,HdAIF-1在血淋巴中表达变化没有显著差异,而鳃中24 h显著下调,192 h显著上调.副溶血弧菌感染实验表明HdAIF-1基因在感染后3、24和48 h均检测到HdAIF-1的表达量显著上调.高温和缺氧应激以及弧菌感染均显示HdAIF-1基因表达量发生显著变化,说明HdAIF-1可能作为免疫因子在杂色鲍应激等状况下发挥重要作用.