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本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV GP5蛋白特异性纳米抗体VHHGP5基因片段为模板,使用PCR对目的片段进行扩增,将扩增的片段经双酶切处理后连接到pColdSUMO-FLAG载体上,随后转化至E.coli TOP 10感受态细胞。经菌液PCR鉴定,将构建成功的重组质粒转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达,表达产物通过Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析表达及纯化后的蛋白,同时使用ELISA方法检测纯化后的纳米抗体效价,并使用Western blot鉴定纯化后的蛋白。SDS-PAGE结果显示,成功获得了大小约36 kDa的重组蛋白,利用原核表达系统制备的PRRSV GP5特异性纳米抗体重组蛋白以可溶性形式表达;ELISA结果显示,该纳米抗体结合抗原的效价为1:50 000;Western blot结果显示,该纳... 相似文献
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为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白单克隆抗体,首先构建猪PRRSV GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,将其作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫4次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建PRRSV GP5基因的原核重组表达载体pGEX-6P-GP5,将其转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原,通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。本研究成功构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,表达并纯化了GP5蛋白。经2~3次亚克隆后获得3株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株,IFA和Western blot对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):384-388
构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中进行表达。以HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白的基因序列为模板,通过RT-PCR扩增获得GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体pGEX-GP5a;将构建的重组质粒转化宿主菌,经IPTG诱导,表达出目的蛋白;表达蛋白采用Western blot方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆出了HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因全长,片段序列为156bp;构建的pGEX-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均正确,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测目的蛋白以包涵体的形式表达,用包涵体纯化法获得该蛋白;Western blot检测表达蛋白的反应原性,结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。本试验成功构建了含有HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了GP5a蛋白,为进一步研究GP5a蛋白的功能提供材料。 相似文献
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为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光分析(IFA)。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64 000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。 相似文献
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为进一步研究PRRSV GP5蛋白的生物学功能,本研究将已分离的PRRSV北美洲型野毒株TA-12的GP5基因分为4段(79 bp~207bp、133bp~330bp、229bp~492bp和382bp~603bp)分别克隆于pGEX-6p-1中,并转化E.coli BL21(Rosetta)细胞进行诱导表达.表达蛋白经纯化后,以间接荧光方法(IFA)检测它们与Marc-145细胞的相互作用.IFA检测结果表明GST-GP5-1和GST-GP5-2融合蛋白均能够与Marc-145细胞结合,而且其结合位点在27aa~110aa区域.本实验为进一步研究GP5蛋白生物学功能提供试验依据. 相似文献
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应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因 总被引:3,自引:0,他引:3
将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。 相似文献
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为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞(命名为3E10),经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示:该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及纯化 总被引:1,自引:1,他引:0
利用含有PRRSV N蛋白基因的重组表达质粒pREST-N的大肠埃希菌,在37℃条件下,用终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,目的基因高效表达出分子质量约为17.8 ku的可溶性融合蛋白,分子质量与预期设计的N蛋白大小相符。经His-Ni2+柱亲和层析纯化后,得到了高纯度的N蛋白。通过Western blot分析,该重组N蛋白与兔抗PRRSV高免血清能够发生特异性反应,说明其具有良好的反应原性,为进一步研究PRRSV的抗体检测方法及诊断抗原的批量生产工艺奠定了基础。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deletingM),将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4~1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。 相似文献
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为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较。结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332) 的核苷酸序列同源性分别为88.8%、99.5%、88.7%、88.7%和83.5%。系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型。以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据, 同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献