竹节人参角鲨烯合成酶基因的克隆与生物信息学分析

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)属于五加科(Araliace-ae)人参属(Panax)植物,是传统的名贵中药材,人参属的所有植物均具有较高的药用价值,其主要活性成分是皂苷[1-2]。人参根的总皂苷含量为2%～7%,而竹节人参(Panax japonicus C.A.Mey.)根的总皂苷含量高达15%以上,约为前者的2～7倍、西洋参的3倍,是总皂苷含量最高的人参属植物[2-3]。人参皂苷属于类异戊二烯代谢途径三萜类合成支路的     

紫菜薹花青素合成酶基因BcANS的克隆、表达与序列分析

根据前期在芥蓝中克隆的BaANS基因序列设计PCR引物,从紫菜薹(Brassica campestris var.purpurea)子叶中克隆到基因组DNA和cDNA序列,基因定名为BcANS;序列已提交NCBI数据库,登录号为GQ120562;BcANS的基因组DNA全长为1 637 bp,具1个560 bp的内含子,编码区全长为1 077 bp,编码358个氨基酸.RT-PCR检测结果表明:BcA NS在光照条件下表达,在暗培养植株的子叶和胚轴中未见表达;缺磷植株的子叶和胚轴在暗培养和光照培养下BcANS基因均有表达,但光照条件下的表达量较大.序列比对结果表明:BcANS与同科的甘蓝、芥菜和拟南芥的同源性最高,而与禾本科植物的同源性最低,在进化树上相距最远.对紫菜薹花青素合成酶基因的克隆和表达分析,为进一步开展基因功能和花青素生物合成机制研究奠定了基础.     

人参二醇组皂苷的药理学研究概况

查阅了大量文献,从以下几个方面对人参二醇皂苷的药理学研究进行了系统概述:对神经系统的作用、对心血管系统的作用、对失血性休克保护机理的研究、对脂代谢的作用对生殖功能的作用、对蛋白质表达和核酸合成的作用、对免疫功能的影响以及对肾功能的作用等,从中可以看出人参二醇皂苷有极强的药理活性。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析

采用PCR法克隆了洋葱的花青素合成酶基因AcANS,并对其进行序列比对和生物信息学分析。结果表明,其开放阅读框为1059bp,编码352个氨基酸残基;具有一个富含AT的内含子,符合GT—AG规则;其蛋白质第210～309肽段含有20G—Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域。     

山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析与原核表达

以山桃叶片为材料提取RNA,反转录后得到c DNA,通过PCR扩增得到1个山桃醇腈酶基因全长编码序列,并命名为Pd HNL1。Pd HNL1的开放阅读框为1 737 bp,预测编码蛋白包含539个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明,Pd HNL1编码的蛋白具有葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶的序列特征,与黑樱桃醇腈酶Ps HNL4蛋白相似度为92%,与桃假定的HNL蛋白相似度为77%。通过将Pd HNL1基因连接到原核表达载体p ET28(a)上,并转化大肠杆菌BL21(DE3)后,成功构建了原核表达重组菌株。SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受IPTG诱导表达,分子量大小约为62.4 ku,与已报道的其他蔷薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。     

温度和酸的种类对人参二醇得率的影响

目的研究温度和酸的种类对人参总皂苷酸水解的影响，从而确定人参二醇的最佳制备工艺。方法以人参总皂苷为原料，在规定温度分别以10％3种酸、50％乙醇溶液为溶剂，水浴回流水解4h，水解液回收乙醇后用氯仿萃取，氯仿层合并回收氯仿，残渣用甲醇溶解，用薄层扫描仪测定含量。结果80℃时，盐酸、硫酸和硝酸人参二醇得率分别为10．15％、8．81％和16．69％；90℃时，分别为1．80％、11．02％和2．14％；100℃时分别为0．47％、13．70％和2．35％。结论盐酸和硝酸温度越高，人参二醇含量反而降低；硫酸温度越高，人参二醇得率越高且纯度高。因此，人参二醇最佳的制备方法应为100℃、10％硫酸水解。     

二醇型、三醇型人参皂苷对白菜白斑菌和菜豆菌核菌的影响

为了探讨人参二醇型、三醇型皂苷对白菜白斑菌和菜豆菌核菌的影响,本文采用菌丝生长率法和孢子萌发实验研究人参二醇型、三醇型皂苷对2种病原菌的影响.结果表明:不同质量浓度的人参二醇组皂苷和三醇组皂苷对白菜白斑菌、菜豆菌核菌的影响结果大致相同,在培养初期(24 h)均表现出一定的促进效果,且低质量浓度处理尤其明显;随着培养时间增加,各处理按照质量浓度高低的顺序先后表现出不同程度的抑制作用,并且抑制效果逐渐增强;所有处理中的高质量浓度人参皂苷对病原菌生长的抑制作用最为显著;不同质量浓度的人参二醇组皂苷和三醇组皂苷对2种病原菌孢子或菌核萌发的作用总体上呈低促高抑,且与皂苷质量浓度关系密切.可见,高质量浓度的人参三醇型皂苷有防治白菜白斑菌流行的潜力,而高质量浓度的人参二醇型皂苷有防治菜豆菌核菌流行的潜力.     

人参PgPI基因3'端序列的克隆与分析

MADS-box基因编码的蛋白为转录因子,在被子植物花发育调控中发挥关键作用。其中,PI-like基因主要调控花瓣和雄蕊的形成。利用3'-c DNA末端快速扩增技术,从人参花蕾中克隆得到1个PI-like基因,命名为Pg PI。该基因的3'端序列长558 bp,编码186个氨基酸,GC含量为41.9%。序列比对结果显示,Pg PI与Hh PI(Hedera helix,ADM88561)的相似度为87%。聚类分析结果表明,人参与洋常春藤的PI-like基因聚为一支,进化距离较其他物种近。     

蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆与表达研究进展

蔗糖是植物中重要的代谢产物,它直接或间接参与多种生理生化反应,研究其含量的变化规律对提高植物生物学产量和增强植物抗逆性具有重要的指导意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖代谢的关键酶之一,它催化蔗糖代谢中的限速反应,SPS基因在分子水平编码调控SPS。研究SPS基因克隆与表达规律是从分子水平揭示蔗糖代谢的基础。本文综述了近年来SPS基因克隆和表达研究进展,并展望了SPS基因的研究前景和应用前景。     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

人参茎段组织培养研究

以MS为基本培养基,附加不同浓度的2,4-D、NAA、6-BA,研究不同激素水平对人参茎段诱导不定芽的影响。结果表明:MS培养基+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5 mg/L诱导效果最好,出芽率可达100%。不定芽在适宜培养基上能快速增殖。带腋芽茎段在培养过程中可产生丛生芽,经继代培养可大量增殖。小苗在1/2 MS培养基中容易生根,健壮小苗经驯化后移栽,成活率可达100%,建立了人参的快繁体系。     

苏淮猪VRTN基因克隆、组织表达特征与多态性分析

【目的】获得苏淮猪VRTN基因编码区序列,了解其序列特征和组织表达特征,分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【方法】以苏淮猪卵巢组织cDNA为模板,采用克隆测序技术分离获得苏淮猪VRTN基因编码区序列。利用BioEdit 7.0软件分析其序列特征和蛋白理化性质。利用Clustal W软件进行核苷酸和蛋白质序列比对分析。利用UCSC基因组浏览器与NCBI基因组数据库进行猪VRTN基因的染色体定位和基因组结构分析。利用SMART软件预测蛋白质功能域,CPHmodels软件预测蛋白质三级结构。随机选取3头成年苏淮猪母猪,屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、肌肉和卵巢等组织,提取组织总RNA,采用RT-PCR技术分析苏淮猪VRTN基因的组织表达谱。采集106头成年苏淮猪繁殖母猪耳组织样,提取基因组DNA,采用 PCR-凝胶电泳分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【结果】苏淮猪VRTN基因编码区序列全长为2 097bp,与其它哺乳动物如人、小鼠、牛和羊的一致性分别为84.98%、74.53%、85.84%和86.45%,而与鸡的一致性只有54.42%。基因组结构分析发现猪VRTN基因由2个外显子和1个内含子构成,定位在猪7号染色体上。苏淮猪VRTN基因编码蛋白含有698个氨基酸残基,与人、小鼠、牛和羊等的一致性分别为85.55%、70.07%、86.20%和86.06%,但与鸡的一致性只有51.17%,可见哺乳动物VRTN基因在进化过程中比较保守。氨基酸组分分析显示苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20种氨基酸,其中Leu（亮氨酸）含量最高,达到10.44%,而Asp天冬氨酸含量最低,只有1.43%。蛋白结构分析发现苏淮猪VRTN蛋白含有 HTH结构域等典型结构域,由6个α螺旋、5个β折叠以及若干无规则卷曲组成。RT-PCR分析表明VRTN基因在苏淮猪心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、卵巢和肌肉组织等组织中均有表达,说明VRTN基因是一个广泛表达的基因。在苏淮猪群体中检测到VRTN基因ins291位点的3种基因型,其中仅有93bp条带的为野生纯合型（wt/wt）,仅有384bp条带的为突变纯合型（Q/Q）,含有384和93bp条带的为杂合型（wt/Q）。在苏淮猪群体中wt/wt型为优势基因型,基因型频率为0.717;wt为优势等位基因,基因频率是0.816;高脊椎数等位基因Q的频率为0.184。遗传多态性分析发现苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态信息含量为0.331,为中度多态位点,杂合度为0.40,变异程度相对较低。【结论】 获得了苏淮猪VRTN基因序列,其表达无组织特异性;苏淮猪群体中存在高脊椎数等位基因Q。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

人参组织培养的多因子正交试验研究

采用L9(34)正交设计分析比较了2.4-D,BA,NAA,KT 4种激素浓度及其组合对人参组织培养的影响。经直观分析、方差分析和多重比较进行综合评价,确定人参愈伤组织诱导的最优培养基为MS 2.4-D3 mg/L BA 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L KT 0.5 mg/L,人参愈伤组织生长的最优培养基为MS 2.4-D 3 mg/L KT 1 mg/L,人参不定芽发生的最优培养基为MS BA 1 mg/L。     

葡萄白藜芦醇合酶基因cDNA克隆及原核表达

从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的RS基因编码的氨基酸同源性达到97%以上,与其他属的RS基因编码的氨基酸同源性达到64%以上。生物信息学分析表明,该蛋白分子量为43kD,等电点pI=6.2,包含392个氨基酸残基。将RS的全长cDNA插入到表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-RS,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol.L-1IPTG诱导4h时该基因表达效果最好,诱导产物为1个约43kD的蛋白,为...     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。