嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测

从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。     

鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离、鉴定鲤鱼嗜水气单胞菌。[方法]从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子和16S rRNA基因序列的测定,研究分离菌的形态、生理生化特征及致病性。[结果]分离到的2株优势菌的菌落形态特征基本一致,经鉴定,确认为嗜水气单胞菌。无菌滤液试验表明,鲤鱼细菌性败血症不是由病毒引起的。腹腔注射分离菌菌悬液的鱼在7 d内全部死亡,人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又可分离到该菌株。分离提纯的致病菌株产生了β-溶血环,经蛋白酶试验为阳性。16S rRNA基因序列同源性分析发现同源性为98%。[结论]嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的致病菌。     

乌鳢烂身病病原的分离鉴定及病理组织观察

为探究乌鳢Channa argus烂身病的病因及患病乌鳢的体表组织病理学变化,从广东中山某养殖场患烂身病乌鳢病灶处分离到一株优势菌ZS20200317,通过形态学特征、革兰氏染色、16S rRNA及生理生化特性对分离菌株进行鉴定,并检测了该菌株的药物敏感性,最后采用回归感染试验确认分离菌株为导致乌鳢烂身病的病原菌.结果表明:患病乌鳢烂身处的肌肉组织出现了明显变性、坏死和炎症细胞浸润;LB琼脂培养平板培养结果显示,该菌呈边缘光滑有光泽的圆形白色菌落,为革兰氏阴性菌;16S rRNA基因进化分析显示,菌株ZS20200317与维氏气单胞菌Aeromonas veronii的亲缘关系最近,一致性高达98.5％;生理生化试验显示,该菌的赖氨酸脱羧酶、甘露醇、覃糖、蔗糖、氧化酶和VP等生理生化反应为阳性;药敏试验显示,该菌对氯霉素、头孢他啶、头孢氨苄、头孢唑林和头孢拉定沙星等20种抗生素药物敏感,对氨苄西林、苯唑西林、羧苄西林、青霉素G、麦迪霉素、万古霉素和克林霉素7种药物具有耐药性;人工回归感染试验证实,该菌能引起健康乌鳢死亡.研究表明,维氏气单胞菌是广东中山地区乌鳢烂身病的病原,本研究结果为乌鳢维氏气单胞菌病的防控提供了理论依据.     

青鱼肠道出血症病原菌的分离与鉴定

从患典型肠道出血症的青鱼肝脏中分离到1株致病菌BCB01,人工腹腔注射感染试验可复制出与自然发病相似的症状。单克隆菌落的Biolog系统鉴定结果表明,菌株BCB01为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。进一步的16S rRNA基因测序与系统进化树分析结果表明,菌株BCB01与嗜水气单胞菌(EF645799)的亲缘关系最近,其相似性为99%。药物敏感性试验结果显示,该菌株对大多数试验药物敏感,其中对复达欣、头孢西丁、先锋必等11种药物高度敏感。     

辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

通过RS选择性培养基和针对16S rDNA与气溶素基因的双重PCR检测技术,对采集于辽宁省不同地区、不同鱼类、不同症状病鱼感染的嗜水气单胞菌进行了系统的流行病学调查,并对致病性嗜水气单胞菌进行了毒力验证试验及对抗菌药物的敏感性试验。结果发现,51株临床样本中有26株分离菌扩增得到685 bp大小的目的片段,证明为嗜水气单胞菌,占分离细菌总数的50.98%,占绝对的优势,其中以出血症状为主的病鱼分离的菌占23.99%,以肠炎为主症状的病鱼分离菌占17.99%,以烂鳃症状为主病鱼分离菌占9%。26株嗜水气单胞菌中有17株同时扩增出252 bp大小的气溶素基因(aerA),表明这17株分离菌为致病性嗜水气单胞菌。人工感染试验结果表明,致病性嗜水气单胞菌均有毒力且毒力大小差异明显。药敏实验结果显示,嗜水气单胞菌不同分离株对抗生素的敏感性差异很大,对先锋V耐药率高达90%,对新生霉素、红霉素、利福平、四环素耐药率也相对较高,分别为56.2%,42.7%,37.5%,31.1%,而对氟哌酸、链霉素、庆大霉素则较敏感。该结果对建立片区病原库,揭示辽宁地区淡水养殖鱼类感染的嗜水气单胞菌的地理分布、毒力大小、耐药性差异,进而弄清嗜水气单胞菌的表型、基因型差异具有重要理论参考意义。     

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。     

大口黑鲈维氏气单胞菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

为查明引起四川省某养殖场大口黑鲈(Micropterus salmoides)死亡的病因,采用传统方法从患病大口黑鲈内脏组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定其致病性,利用细菌生化微量鉴定管和16S rRNA序列分析鉴定病原菌,采用K-B纸片琼脂扩散法测定病原菌的药敏特性,并采取石蜡切片技术观察病鱼病灶组织的病理特...     

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。     

罗氏沼虾仔虾病原菌的分离鉴定及耐药性试验

从病(死)罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)仔虾的匀浆液中分离到了一株大量生长的优势菌,感染试验表明分离菌对罗氏沼虾仔虾有较强的致病作用。对分离菌进行了形态、培养、生化和理化等表观生物学特性检验,同时对该菌进行了分子生物学鉴定,扩增了该菌的gyrB基因和16S rRNA基因并进行测序和序列同源性分析。综合分离菌的表型特征、理化特性及分子生物学鉴定结果,判定病原菌为气单胞菌属(Aeromonas)的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。采用纸片扩散法(K-B法)测试了分离株对44种抗菌类药物的敏感性,结果表明,供试菌均对所测定的44种抗菌类药物中的氨曲南等24种药物敏感,对青霉素G等8种药物耐药。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的药敏试验

[目的]为研制有效防治鲤鱼细菌性败血症的疫苗提供依据。[方法]从河北省某渔场具有典型细菌性败血症症状的鲤鱼中分离出2株优势菌,对分离菌进行生化鉴定、16S rRNA基因序列测定,并研究分离菌的药物敏感性。[结果]根据2株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),发现2株分离菌均为气单胞菌属的嗜水气单胞菌,认为嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的病原菌。分离到的2株嗜水气单胞菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、加替沙星等15种抗生素均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出了菌株差异。[结论]对嗜水气单胞菌敏感的15种抗生素可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物。     

中国养殖大口黑鲈的亚种分类地位探讨

采用形态学方法和微卫星特异分子标记两种方法鉴定了中国养殖大口黑鲈Micropterus salmoides的分类地位。结果表明：中国养殖大口黑鲈的侧线鳞为58～68片,肋骨数为15对,这与原产地大口黑鲈北方亚种较一致;选择鉴别两亚种的特异性微卫星标记（Md06、Msal21）对中国养殖大口黑鲈进行特异性扩增,并以原产地大口黑鲈佛罗里达亚种和大口黑鲈北方亚种样品作为对照,结果为中国养殖大口黑鲈的特异性扩增片段大小和原产地北方亚种扩增条带相同。综合形态学和分子标记两方面的结果,表明中国养殖大口黑鲈应属于大口黑鲈北方亚种Micropterus salmoides salmoides。     

加洲鲈与罗非鱼群体的RAPD分析

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对加洲鲈和罗非鱼种群间的亲缘关系进行分析。结果显示加洲鲈与罗非鱼之间的带纹相似系数为0．236,遗传距离为0．764。表明加洲鲈和罗非鱼之间的亲缘关系较远。     

加洲鲈与罗非鱼群体的RAPD分析

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对加洲鲈和罗非鱼种群间的亲缘关系进行分析。品种间带纹相似系数（共享度）根据Lynch的公式进行计算：F_（xy）=2N_（xy）/N_x＋N_y（N_（xy）是RAPD指纹图谱中品种X和品种Y的共有带纹数,N_x和N_y分别为品种X和品种Y各自可分辨带纹总数）。品种间的遗传距离（D）根据2个品种的共享度（F）来计算：D=1-F。根据遗传距离的D值,再用UPGMA法求出各类间距离后再聚类。结果显示：从20个随机引物中筛选出4个清晰,多态性丰富的引物用于分析。各种群平均每一引物所获得的带纹数为：加洲鲈7.8±2.45,罗非鱼5.1±1.87。4个引物共扩增出加洲鲈35条带其中特异性带16条,罗非鱼21条带其中特异性带8条,测得加洲鲈与罗非鱼之间的带纹相似系数为0.236,遗传距离为0.764,表明加洲鲈和罗非鱼之间的亲缘关系较远。     

加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈（Micropterus salmonoides）体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌,经革兰氏染色和磷钨酸负染后,使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定,基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定,经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤,同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株（180803bj_jzl）,为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌,Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示,分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支,与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上,gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%,临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积,肝细胞质内有大量空泡,呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清,脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离,呈球拍状,部分上皮细胞坏死脱落,只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感,对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡,且具有较强的毒力,致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤,实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。     

大口黑鲈感染温和气单胞菌抗氧化功能的研究

剖取由温和气单胞菌感染后发病的大口黑鲈及健康大口黑鲈的心脏、脾脏、肾脏、鳃、肌肉、肠、肝7种组织,分别采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光还原法和硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量.研究结果表明,发病大口黑鲈的心脏、脾脏、肾脏、鳃、肝5种组织的SOD活性显著(P＜0.05)低于健康大口黑鲈,而MDA含量显著(P＜0.05)高于健康大口黑鲈.发病大口黑鲈的肌肉、肠组织SOD活性与MDA舍量与健康大口黑鲈相比差异不显著.研究结果提示温和气单胞菌可导致大口黑鲈的心脏、脾脏、肾脏、鳃和肝等组织SOD活性降低,MDA含量升高,进而使其抗氧化功能降低,组织受损,甚至发病.     

大口黑鲈两个地理群体形态差异及其对体质量的影响

随机选取广东和台湾两个不同地理群体大口黑鲈（Micropterus salmoides），采用多元分析方法分析了两地理群体间形态性状差异及其对体质量的影响.结果表明，广东和台湾两地理群体间的大口黑鲈形态差异主要集中于躯干中部和尾部.前3个主成分累积贡献率达到95.8%.前2主成分因子得分散点图中两地理群体重叠区域较小，可以完全区分.广东群体和台湾群体的形态性状对体质量具有相似的影响效果，其中体高、胸鳍基点至背鳍基点长度、臀鳍基点至背鳍基点长度、臀鳍基点至背鳍末端长度和背鳍末端至尾鳍基点长度对体质量的直接作用达到了显著水平，是影响两地理群体大口黑鲈体质量的关键形态指标.研究结果可为大口黑鲈体质量选种提供基础资料.     

饲料中添加植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响

用添加不同水平植酸酶（0、500、1 000、1 500 U/kg）的饲料喂养初始体重为23 g左右的大口黑鲈Micropterus salmoides56 d,研究植酸酶对大口黑鲈生长和消化酶活性的影响。结果显示：饲料中添加1 000U/kg植酸酶能显著促进大口黑鲈的生长,降低饲料系数（P〈0.05）。1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈胃蛋白酶活性较对照组分别提高了28.14%和20.09%,差异显著（P〈0.05）;各处理组鱼幽门盲囊中蛋白酶活力与对照组相比差异显著（P〈0.05）,而肠道中蛋白酶活性差异不显著（P〉0.05）。与对照组相比,各处理组鱼肝胰脏和肠淀粉酶活性有所提高,但差异不显著（P〉0.05）;1 000、1 500 U/kg组大口黑鲈的胃淀粉酶活性有所降低,但差异不显著（P〉0.05）。     

大口黑鲈早期生长发育规律的研究

为了研究大口黑鲈Micropterus salmodies早期生长的发育规律,选用8个全同胞家系的大口黑鲈,每月从每个家系中随机选取30～40尾,对其体重和体长进行测量。运用Gompertz、Logistic和Von Bertalanffy3种非线性模型对大口黑鲈体重和体长的生长进行非线性曲线拟合分析,同时利用幂函数方法对大口黑鲈体重与体长的生长关系进行分析。结果表明：3种非线性模型均能较好的模拟大口黑鲈体重和体长的生长,而Logistic模型拟合效果更佳;进一步分析体重和体长的最佳拟合参数,发现体重和体长的拐点月龄分别为5.77月龄和4.95月龄,拐点处体重和拐点处体长分别为146.35 g、13.75 cm;幂函数方程能很好地拟合大口黑鲈体重和体长之间的关系,其方程为W=0.076L2.650（R2=0.998）。研究结果可为大口黑鲈养殖中的饲养管理和品种选育提供参考。     

大口黑鲈遗传连锁图谱的构建

采用AFLP技术结合＂拟测交＂策略,以大口黑鲈Micropterus salmoides选育家系作为亲本进行单对杂交产生的F1代家系为作图群体,初步构建了大口黑鲈雌、雄性遗传连锁图谱。结果表明：用64对AFLP引物组合对父母本和106个子代个体进行遗传分析,共得到398个分离标记。母本分离标记有189个,其中172个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记有209个,其中181个符合1∶1孟德尔分离标记。雌性框架图包括75个遗传标记,分布在21个连锁群中,有6个三联体,6个连锁对,标记间平均间隔为18.22cM,图谱总长度为983.8 cM;雄性框架图包括82个遗传标记,分布在22个连锁群中,有7个三联体,5个连锁对,标记间平均间隔为19.22 cM,图谱总长度为1153.2 cM。雌、雄性基因组估算长度分别为1 399.85和1 582.72,图谱的总覆盖率分别达到70.28%和72.86%。     

大口黑鲈和蓝鳃太阳鱼鳃结构的扫描电镜观察

应用扫描电镜对大口黑鲈Micropterus salmoides和蓝鳃太阳鱼Lepomis macrochirus鳃的表面微细结构进行了观察。结果表明：大口黑鲈和蓝鳃太阳鱼鳃的表面结构和微细结构与其它硬骨鱼类基本相似,鳃弓和鳃耙表面被具环形微嵴的上皮细胞所覆盖,表面观凹凸不平;大口黑鲈鳃耙的尖齿直径和长度分别为蓝鳃太阳鱼鳃耙的3.4-3.8倍和2.1-3.8倍;两种鱼的鳃丝末端略为膨大呈勺状,鳃丝表面都具有规则或不规则分布的环形微嵴、沟、坑、孔等结构;大口黑鲈鳃丝之间的距离相对较大,蓝鳃太阳鱼的鳃丝间距离仅为大口黑鲈的83%-88%;大口黑鲈鳃小片的高度、厚度和片间距都大于蓝鳃太阳鱼。文中还比较探讨了大口黑鲈和蓝鳃太阳鱼的形态结构与其生理功能之间的关系。