茶树新梢cDNA克隆测序和表达序列标签(ESTs)特性分析

采用定向克隆法，构建了茶树(Camellia sinensis(L．)O．Kuntze)龙井43和安吉白茶等2个品种新梢cDNA文库。对龙井43cDNA文库共4320个克隆的序列进行了测定，获得有用序列2963个，其中空载体和去除载体后序列短于150bp有416个，重复的有863个，首批共获得1684个茶树ESTs。绝大部分ESTs的长度在300～700bp之间，平均为478bp。通过与NCBI等核酸数据库进行比对、查询和注释，获得已知功能基因或具推测功能的基因130多个(607个ESTs)，新的表达基因1077个，证明ESTs测序分析是一个发现和鉴定茶树功能基因的高效快速新途径。     

花生茎全长cDNA文库的构建与分析

为挖掘花生茎中重要的功能基因,了解花生茎生长发育的分子机理,以闽花6号为材料,利用SMART技术成功构建了花生茎不同生育时期混合的全长cDNA文库,并对文库的部分序列进行了测序及分析。结果表明,该文库原始库容为1.25×106cfu·mL-1,重组率达100%,插入片段大小为750~2 000 bp,平均插入片段大小为1 000bp,达到文库质量要求。随机挑选50个单克隆进行5'端测序,共获得50条有效序列。通过与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因29个,未知功能基因9个,新基因12个,其中47个(94%)基因为花生未报道的基因。因此,该文库的构建为克隆和研究花生茎部重要表达基因,从分子水平上揭示花生茎的生长发育规律提供了基础。     

苎麻茎皮EST数据库构建及肌动蛋白解聚因子（ADF）和β-tubulin基因时空表达分析

本研究以封行期的苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)的茎皮为材料构建cDNA文库.从文库中随机挑选400个克隆测序获得274条有效序列(GenBank登录号为EH041928～EH041933,EH667190～EH667251,ES584534～ES584595和FG588817-FG588960).生物信息学分析表明:拼接出217个假定独立转录本(TUT),冗余度为20.8%.Blast比对结果获得了91条已知功能基因或具推测功能的基因,其余183个ESTs为未知基因.91条具已知或推测功能的ESTs大致分为9类,其中与细胞壁有关的ESTs占5.5%.对与细胞壁有关基因中的肌动蛋白解聚因子(ADF)和β-tubulin基因进行半定量RT-PCR分析,结果显示这两个基因在4个生长期和5个组织中均有表达,在封行期的茎皮高度表达.提示ADF和β-微管蛋白基因的表达具有时空特异性.     

松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析

松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。     

稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析*

利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。     

大白菜花蕾败育相关基因的cDNA-AFLP差异表达分析

本研究以大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson)败育花蕾到正常花蕾的10个连续时期的花蕾为材料,采用cDNA-AFLP技术和生物信息学分析等方法研究了败蕾过程中的基因表达差异,获得了192个大白菜败蕾相关差异表达片段,随机挑选88个序列进行测序,获得72个新表达序列标签(ESTs),将长度大于100 bp的67个ESTs在GenBank进行了登录,登录号为GR308155-GR308221.根据生物信息学分析结果,其中Blastx比对分值大于80的62条ESTs可分为能量和新陈代谢、膜和运输、转录和翻译、氨基酸合成和加工、信号传导、防御及分类不确定7类.其中EST46、EST3-1、EST13-2、EST20-1和EST30-2等5个ESTs为大白菜花蕾败育材料中新发现的.     

长穗偃麦草逆境诱导cDNA文库的构建和初步鉴定

长穗偃麦草是小麦的野生近缘植物之一,具有抗多种生物胁迫和非生物胁迫的优良基因。为了从中发掘耐盐基因,分别用100、200、300、400 mmol·L~(-1)的Na Cl和20%、30%、50%(w/v)的PEG-6000处理长穗偃麦草幼苗,采用改良的SMART方法合成逆境诱导条件下的全长c DNA。采用Gateway技术中的BP反应构建长穗偃麦草全长入门c DNA混合文库,滴度为4.0×106cfu·m L~(-1),库容量为2.0×107cfu,插入片段平均长度为0.75 kb,重组率达98.9%。将该入门文库重组到植物转基因双元载体p MDC83中,获得目标文库,其原始滴度为6.0×106cfu·m L~(-1),库容量为3.0×107cfu,插入片段平均长度为0.45 kb,重组率达100%。通过农杆菌侵染萌发花粉再授粉的方法,获得转基因玉米T0种子,转化率达3%;用农杆菌侵染法将农杆菌与烟草BY-2细胞共培育,成功将目标文库转入到烟草BY-2细胞中,在培养基中加入潮霉素和不同浓度的Na Cl溶液,筛选获得耐盐细胞系69个。研究结果为大规模快速筛选鉴定植株水平和细胞水平上的抗盐基因奠定了基础。     

大猿叶甲转录组测序及生物学信息分析

大猿叶甲(Colaphellus bowringi)是一种常见的蔬菜害虫,由于目前其全基因组尚未公布,各种相关基因信息无法得知,导致大猿叶甲基因功能研究进展缓慢。本研究利用新一代高通量测序技术结合生物信息学分析,获得了大猿叶甲完整的转录组数据,并将获得的原始数据上传至NCBI获得ID号:SRP125298。共获得40 489条Unigenes,利用Blast X比对NCBI蛋白数据库(NCBI Non-redundant Protein Sequences,NR)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、Swiss-Prot蛋白质序列数据库(Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database,Swiss-Prot)、蛋白质家族的集合数据库(Protein Family,Pfam)、NCBI核酸序列数据库(NCBI Nucleotide Sequences,NT)、基因本体数据库(Gene Ontology,GO)、真核生物蛋白质同源簇数据库(eu Karyotic Ortholog Groups,KOG),对所有Unigenes进行注释,结果显示共计19 955个Unigenes得到注释。分别有17 437、4 158、6 817、12 129、15 890、8 641、11 416个Unigenes注释到上述公共数据库。对所有Unigenes进行SSR分析发现,共计2 992个SSR存在于2 692条Unigenes上,平均长度14.61 bp。其中单核苷酸和三核苷酸所占比例最大,分别为65.51%和21.76%,二者分别以A/T和TTA/TAA重复基元为主(分别占94.95%和8.45%)。研究发现共有115种重复基元,其中二、三、四核苷酸重复基元分别有12、60、38种;基序重复频率介于5~50次,基序长度主要分布于10~20 bp。本研究通过对大猿叶甲转录组原始数据的获得,为种属鉴定及遗传多样性的分析提供基础资料。     

杂种和纯种猪之间脂肪组织差异表达基因的分离、克隆和序列分析

实验选取中国地方品种梅山猪和外国品种大白猪进行正反向杂交产生杂种梅大和大梅猪，用mRNA差异显示技术，分析了亲本和杂种猪背部皮下脂肪组织间基因差异表达。结果发现，在10条5＇端随机引物和10条3＇端锚定引物共100对引物组合的差异显示扩增下，共获得l500多条可重复的扩增条带，选取其中能够重复出现的40条差异表达带（在4组样本中不能同时出现的条带）进行重扩增、克隆并测序。通过GenBank／BLAST比对发现，其中有4条EST分别与GenBank序列同源性较高，其余36条属于新的EST，将这36条EST提交GenBank获得注册号，并选取其中的3条进行半定量RT-PCR验证并检测其相对表达，其中2条表现不同程度的差异，l条没有明显差异。为提高DDRT-PCR真阳性，实验中的4种组合各屠宰6头以建立RNA池，采取低高严谨结合的退火温度进行差异显示扩增以及只回收在2次PCR扩增均能重复出现的条带。结果表明，所获得的36条新的EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同，这些差异表达的基因可能与脂肪组织杂种优势的形成有关。     

植物EST-SSR标记开发及其应用

随着生物科技的进步,大量的植物表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）已经成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记,其多态性可能与基因功能直接相关,而且在相近植物间具有良好通用性,使得EST-SSR标记在实际应用中更具价值。采用计算机方法大规模发掘EST-SSR多态性位点极大地提高了SSR标记开发效率。尤其随着新一代测序技术的成熟以及测序成本的急剧下降,利用新一代测序技术产生大量的转录组数据进行EST-SSR多态性标记的计算机大规模发掘将对SSR标记的开发带来深远影响。本文简要介绍了植物EST-SSR分布特点,并对EST-SSR标记开发现状以及相关应用作了综合评述,此外,还对EST-SSR标记的计算机开发新策略进行了展望。     

绵羊皮肤源EST-SSR标记与羊毛性状的关联性分析

为了筛选与绵羊(Ovis aries)毛性状基因座连锁更强的分子标记,本研究选择9个多态性丰富的绵羊皮肤源EST-SSR位点,检测了德国美利奴羊与中国美利奴羊级进杂交F2代群体的遗传多态性,并分析了标记与毛性状间的关联性.分析结果显示,所选的9个EST-SSR位点在供试群体中共检测到39个等位基因,多态性丰富,其中的6个位点基因型间存在显著差异;其中,与自然长度关联的位点有5个,与伸直长度关联的位点有4个,与纤维直径关联的位点有3个.6个EST-SSR位点基因型间存在显著差异;关联性标记对羊毛性状相关效应的F检验结果表明:33176918位点和33176988位点分别对羊毛自然长度、纤维平均直径具有显著的遗传效应(P＜0.05).研究结果提示,与羊毛性状相关的6个位点中,33176918号位点对羊毛的自然长度有较大的标记效应,该位点的CD基因型是羊毛自然长度的有利基因型;33176988号位点对羊毛的纤维直径有显著地标记效应,该位点的BC基因型是纤维直径的有利基因型.这两个位点可能与控制毛形状的基因座紧密连锁.     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

青海省耕地资源开发利用分析及对策研究

分析论述了青海省耕地资源开发利用的现状、特点和问题。在此基础上,提出了对青海省耕地资源进行研究的框架体系和思路,同时基于GIS/RS技术设计了相关的技术路线。最后依据所做设计对青海省耕地资源开发利用做了初步分析,并进行了相关的对策研究分析。     

氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用

为观察氟对成年雄性小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用,通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型及锌保护实验。采用石蜡切片、苏木精-伊红染色(HE染色)、末端原位标记(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠生精细胞的凋亡情况。结果显示:(1)氟感染组无论是低剂量组(NaF10 mg/kg)或是高剂量组(NaF 20 mg/kg)生精细胞都发生了明显的凋亡。生精细胞凋亡主要发生在精母细胞和精原细胞,凋亡指数与对照组差异极显著(P<0.05)。(2)无论是高剂量锌(ZnSO430 mg/kg)和低剂量锌(ZnSO415 mg/kg)都可以使凋亡指数明显降低,高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显著(P>0.05)。     

荔枝种子结构的扫描电镜观察

荔枝种子从果实中剥离出来后, 即使在室内条件下, 也极易失水干缩, 潮湿环境中又易发霉而腐烂。扫描电镜观察表明: 种皮上布满纹孔, 水分散失面积很大; 种脐部为疏松的海绵组织, 且营养丰富。据此, 生产上应对种子彻底清洗, 并保存于适当湿度的环境中, 以提高其发芽率。