猪圆环病毒Ⅱ型抗体间接ELISA检测方法的建立

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测.用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法.ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10%.用该方法分别检测湖北、河南等地的91份临床血清样品,阳性率为25%～100%.上述结果表明,所制备的目的蛋白具有较高的纯度和良好的免疫原性,所建立的间接ELISA检测抗体方法,具有良好的重复性,初步临床试用效果良好.     

猪圆环病毒2型的血清学检测

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(His-CAP2)为抗原,通过方阵ELISA滴定,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg·mL-1,待检血清稀释度为1:40,建立PCV2的血清流行病学的间接ELISA监测方法.通过对已知PCV2血清及其他病毒血清的试验,表明该ELISA方法具有良好的特异性.利用该方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行检测,PCV2抗体阳性检出率为70.29%,与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况相符合,证实了此方法临床应用的可行性.     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。     

双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备

纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。     

Fh8明显增强PCV2 Cap蛋白的可溶性表达及抗原性

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的主要功能蛋白Cap蛋白,很难在体外获得可溶性表达。本研究旨在以Fh8蛋白为融合标签实现PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的可溶性表达,以小鼠评价可溶性Cap蛋白的抗原性。以病毒基因组为模板,扩增ORF2靶基因,插入p Cold原核表达质粒,成功构建的p Cold-ORF2阳性质粒转入大肠杆菌BL21中。利用SDS-PAGE分析Cap蛋白的可溶性表达情况,利用Western blotting鉴定Cap蛋白的反应原性。重组蛋白与佐剂乳化制备免疫原,免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中Cap抗体,利用PCR检测组织脏器中病毒载量,以评估可溶性Cap蛋白的免疫原性。PCR结果表明,Fh8和PCV2 ORF2基因被成功扩增。SDS-PAGE结果表明Fh8标签显著提高了ORF2在大肠杆菌中的可溶性表达,分子量35 000。Western blotting结果显示,猪PCV2阳性血清能够特异性的识别可溶性Cap蛋白。小鼠一次接种Cap蛋白28 d后,抗体全部转阳,免于PCV2的攻击。表明通过新型小标签实现了PCV2 ORF2基因的可溶性表达,且具有良好的免疫原性。     

鸭圆环病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操作简便,可以低成本、大规模地检测鸭圆环病毒抗体。     

基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法，为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因，将其与pQE 30表达载体连接，并进行原核表达，对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组VP3蛋白（rVP3）作为包被抗原，通过矩阵法优化ELISA反应条件，建立检测SVA抗体的间接ELISA方法，通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值，并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证。将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清，分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测，对比两者检测结果。【结果】成功克隆717 bp的VP3基因，表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白（rVP3）。Western Blot试验结果表明，纯化的 rVP3 蛋白具有良好的反应原性。建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法，当样本OD₄₅₀(S)/阳性对照OD₄₅₀（P）＞0.138时判定为SVA抗体阳性。该方法特异性强，与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应；敏感性较好，检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致；重复性和稳定性好，批内变异系数小于4%，批间变异系数小于9%。160份血清检测结果表明，两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异。【结论】建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法，该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。     

猪圆环病毒Ⅱ型血清抗体ELISA检测方法的建立

为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次重复试验,方差分析显示P0.05,差异不显著;与PCV2-ELISA试剂盒(INGEZIM公司生产)的符合率比较,其总符合率达88.89%.可见,优化建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性高、稳定性好,可用于PCV2血清学诊断和血清学普查.     

三峡库区“四化”同步推进的途径与对策

本文对三峡库区工业化、信息化、城镇化、农业现代化同步推进进行了实证分析,发现库区"四化"同步发展存在城镇化滞后于工业化,农业现代化水平低和工业支撑能力不足的问题。提出了以新型城镇化理念加快推进库区城镇化,以特色生态农业提升农业现代化水平,以新型工业实现库区工业生态化,并同步推进信息化的"四化"同步发展途径。从加快区域性中心城市和小城镇建设、大力构建新型农业经营体系、科学选择工业主导产业和大力发展战略性新兴产业四个方面提出对策建议。     

镉胁迫对3个水稻品种(系)根系生长及有机酸和氨基酸分泌的影响

以水稻亲本蜀恢498、Ⅱ–32A和杂交稻Ⅱ优498为试材,通过营养液培养试验,研究不同镉胁迫时间(7、14 d)和不同质量浓度(0、0.5、1.0、3.0 mg/L,0为CK)Cd Cl2处理下的水稻根系生长情况以及根系有机酸和氨基酸的分泌特征。结果表明:与对照相比,在镉胁迫7 d和14 d时,各质量浓度的Cd Cl2处理下3个水稻品种(系)的根系干重减轻,根系总数变少,根系表面积和根系体积变小,根系总长变短,且对根系总数、根系总长、根系表面积等的影响达显著水平;当镉胁迫7 d和14 d时,蜀恢498、Ⅱ–32A和Ⅱ优498分泌的有机酸和氨基酸含量均随Cd Cl2质量浓度的增加呈先增加后减少的趋势,都在Cd Cl2质量浓度为0.5 mg/L时达最大,胁迫7 d时,3个品种(系)的有机酸含量分别为3.44、3.31和3.43 mg/g,氨基酸含量分别为41.07、42.03和40.53μg/g,胁迫14 d时,3个品种的有机酸含量分别为3.40、3.38和3.33 mg/g,氨基酸含量分别为34.95、35.95和35.28μg/g,各处理与对照相比,差异均达显著水平;分泌的有机酸组分中以草酸含量较高,其次是苹果酸;分泌的氨基酸组分中甘氨酸含量相对较高,其次是丝氨酸和苏氨酸;品种(系)间比较,在镉胁迫7 d和14 d,Cd Cl2质量浓度为0.5 mg/L时,3个品种(系)根系分泌的有机酸和氨基酸含量差异没有统计学意义,而在中浓度(1.0 mg/L)和高浓度(3.0 mg/L)镉胁迫下Ⅱ优498分泌有机酸和氨基酸含量显著高于其亲本蜀恢498和II–32A。     

基于顾客价值的都市农业发展战略研究

都市农业在满足城市化过程中日渐增加的农副食品供应、安全健康饮食、生态环境保持、第三空间营造以及可持续生活方式探索方面具有重要意义.在都市农业概念内涵、种类构成、功能价值等文献研究基础上,对都市农业的产业属性、行业特征与理论框架等方面进行了清楚界定,并基于顾客价值这一现代产业竞争的战略重心提出了都市农业发展的框架性战略方案,认为都市农业发展战略的基石在于顾客价值的创造,方法在于基于不同的都市农业制定差异性的战略方案,关键点在于确保其准公共产品属性的同时全面激活各类市场主体参与的企业家精神.     

宁夏中部干旱带特色产业发展现状与对策

近年来,宁夏中部干旱带特色产业规模不断扩大,市场不断扩展,营销网络逐步建立,发展势头强劲,已经成为当地农民增收的支柱产业。但是,尚存在着水资源严重短缺,产业化经营的规模小、层次低,龙头带动力较弱,产业链条未形成,合作经济组织不健全、科技服务体系不适应等问题。针对存在问题,提出了加大水利基础设施建设、增加投入、扩大规模、壮大龙头、创建品牌、搞活流通、依靠科技、提高效益等对策措施。     

贵州省生态渔业高质量发展路径研究

生态渔业高质量发展是我国渔业发展的战略性目标,研究贵州省生态渔业高质量发展的路径对长江流域和珠江流域贵州段的生态修复,对巩固和扩大脱贫攻坚成果、全面推进乡村振兴、建设生态文明先行示范区等省级决策部署以及共建“一带一路”和碳达峰、碳中和等国家重大战略任务具有重要意义。本研究通过对贵州省生态渔业发展现状走访调研,结合《中国渔业统计年鉴》数据分析,对贵州省“十三五”期间生态渔业发展成效、制约因素及发展机遇进行了梳理。依据贵州省生态渔业发展指导性文件《省人民政府办公厅关于加快推进生态渔业高质量发展的意见》和贵州省生态渔业产业特点,探索性提出贵州省生态渔业高质量发展的理念和基本原则。并进一步从拓展生态渔业空间、推广多样化生态养殖模式、推动产业融合发展、做大做强休闲渔业、加大渔业科技创新投入及完善生态渔业制度保障体系6个方面提出贵州省生态渔业高质量发展的建议与对策,期望为贵州省生态渔业高质量发展提供参考。     

水产公益性科研机构科技人员绩效考评体系研究

针对水产公益性科研机构的公益性、研究性特点,以及传统考评体系过于形式化,导向性、激励性不强,缺少量化指标等问题,根据绩效考评的内容与特征,提出了建构科学合理的科技人员绩效考评体系的思路与措施,以期加强和完善绩效考评指标体系,从而更有效地推动水产社会公益性研究机构科研战略目标的实现。完善绩效考评体系的措施主要包括以下各个方面:首先从"德、能、勤、绩"四个方面来细化考核指标,选择合理的量化指标确定考评指标因素权重,并采用层次分析法确定评价主体可信度权重,然后将每一指标分档次打分后,计算被考评者的综合绩效得分,这样就可得出考评结果。     

金融支持对战略性新兴产业发展的影响——基于中国上市公司的实证分析

基于柯布-道格拉斯生产函数的理论分析,建立面板数据模型并采用上市公司财务数据,实证分析了金融支持对中国战略性新兴产业发展的影响作用。结果表明：以资本市场为主导的直接金融体系相对于以银行信贷为主导的间接金融体系的正向支持作用更为稳健;固定资产净额和无形资产净额对战略性新兴产业发展的不同方面呈现出不同的影响作用;劳动投入水平对战略性新兴产业发展产生显著的正效应。     

国家南繁育制种基地正规化建设的关键问题分析(英文)

通过对南繁科技性与历史性、海南南繁不可替代性、南繁功能价值层次结构以及存在的关键问题进行分析,得出南繁已上升为国家战略,成为国家战略性资源。海南南繁作为科研实践与历史的选择的重大成果,在气候条件、科学育种、粮食生产抗灾救灾、保障种业安全和区位优势等方面发挥着不可替代的作用;同时通过引入价值工程、产业集群、区域经济等理念,在研究南繁的功能、价值和存在的关键问题基础上,建立南繁功能价值的层次结构。但要实现南繁产业集群化发展,充分实现南繁功能价值,必须要解决南繁在顶层规划、试验用地、制度设计、硬件建设和生态安全等方面存在的关键问题。提出了建设南繁育种科研核心保护区、完善南繁法规政策保障机制、健全南繁管理体制、编制实施南繁育制种基地发展规划、争取国家政策资金支持等建议。     

建设黄河上游经济 带实现甘青宁三省区经济社会新跨越

规划建设黄河上游经济带是促进甘青宁三省建立区域优势互补机制,解决地区经济凹陷、缩小发展差距,实现经济社会跨越发展的战略选择。本文立足三省实际,从政策、区位、资源、能源、交通、生态优势条件分析入手,探讨经济带建设仍面临的诸如城市规模偏小、竞争力弱、城乡差距大、增长方式转变深层次矛盾多、局部区域生态环境继续恶化等不利因素。提出建立黄河上游经济带的战略构想,即遵循科学规划、区域一体化、循序渐进、产业支撑四个原则,突出协调发展联席制度建立、城乡一体化发展、交通、通信等基础设施建设、特色鲜明优势产业体系、全方位对外开放体系及人与自然和谐生态环境体系的构筑六项重点工作。     

湖南现代农业发展对策研究

提出了湖南现代农业战略定位是“一个基地,三个中心”：即国家粮仓基地,主要农产品生产与加工中心,农业物流中心,科技创新中心。并就重点支持优势农产品产业开发,着力打造湖南现代农业产业体系;创新体制机制,形成推进湖南现代农业发展的强大合力等方面进行了系统论述。