一种DNA疫苗载体-磷酸钙纳米颗粒的基因转染能力评价

[目的]评价磷酸钙纳采颗粒的基因转染能力,确定其是否具有潜在的DNA疫苗佐剂活性.[方法]以柠檬酸钠作为分散荆,通过共沉淀法合成粒径分布狭窄的磷酸钙纳米颗粒.通过细胞毒性试验评价其安全性,并利用荧光显微镜和流式细胞仪对其基因转染能力进行评价.[结果]成功制备了粒径分布狭窄的磷酸钙纳米颗粒,其平均水合粒径和表面电势分别为692.6 nm和-11.1 mV.同时该材料对293T细胞无明显的毒性作用,且可显著提高pEGFP的细胞转染效率.[结论]柠檬酸钠修饰的磷酸钙纳米颗粒安全性好,具有较强的基因转染能力,是一种潜在的DNA疫苗载体或佐剂.     

PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

 【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200 nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P＝5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P＞5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。     

阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究

研究阳离子脂质体在不同细胞中的转染效率及毒性。首先采用DNA延滞实验研究Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂与DNA的结合能力。然后选用绿色荧光蛋白的质粒pGFP-N2作为报告基因模型和转染试剂制成复合物后转染Hela、7721、HT29细胞,比较多种因素对转染的影响。最后使用MTT比色法分析Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂对细胞的毒性。随着复合物中转染试剂比例的增加,Lipofectamine2000、DOTAP与DNA结合能力逐渐增强。Lipofectamine2000在Hela细胞转染最高效率约72％;在7721、HT29细胞转染效率较低。DOTAP在3种细胞的转染效率都很低;在转染效率最高时2种转染试剂的细胞存活率均在90％以上。对商品化的转染试剂研究和讨论以期为阳离子类脂非病毒载体的研究提供参考。     

细胞种类对阳离子脂质体介导基因转染的影响

[目的]为非病毒载体阳离子类脂的研究提供参考。[方法]以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体,通过DNA延滞试验和质粒转染试验,研究Lipofectamine 2000对不同细胞(HeLa cell、B16 cell、MCF-7 cell和SW-480 cell)的转染效率,将其与其他转染试剂Sofast和DOTAP进行比较,并探讨细胞种类对Lipofectamine 2000转染效率的影响。[结果]随着复合物中转染试剂比例的增加,DNA延滞作用明显增强。当Lipofectamine 2000与DNA的质量比增至51:时,仅有小部分DNA移出原点。Lipofectamine 2000对SW-480cell的转染效率明显高于其他3种细胞。Lipofectamine 2000对B16细胞株的转染效果要优于Sofast,而Sofast与DOTAP的转染效果相当。[结论]Lipofectamine 2000对多数细胞具有较高的转染效率,并不适合所有类型的细胞。     

聚赖氨酸接枝淀粉共聚物的制备及其作为基因载体的研究

以还原胺化反应制得PLL-S共聚物,并通过红外光谱以及核磁共振对其进行了结构表征,采用凝胶渗透色谱法检测了PLL-S的相对分子质量,激光粒度分析仪检测了其电位,琼脂糖凝胶电泳法研究了其结合DNA的能力及抗DNaseⅠ的能力,MTT法分析了PLL修饰前后的细胞毒性,并研究了其在293T细胞中转染质粒DNA的能力。结果表明：制备的PLL-S共聚物接枝率为2.8%,数均相对分子质量为60629,电位为23.7mV,达到细胞毒性评价等级0级和1级,材料是合格的,可结合DNA且能保护DNA免受DNaseⅠ的破坏,在293T细胞中的转染效率达到了（48±3.2）%。经对PLL-S的性能分析可以判断：该共聚物可作为基因载体在生物医学方面予以应用。     

多聚赖氨酸-硅纳米的制备及体外转染HepG2细胞的研究

目的观察多聚赖氨酸-硅纳米颗粒作为基因转染载体体外转染肝癌细胞系HepG2细胞的可行性。方法自制硅纳米颗粒并用多聚赖氨酸修饰,与增强型绿色荧光蛋白基因质粒(pEGFP-C1)结合后体外转染HepG2细胞,观察转染后绿色荧光蛋白表达情况,计算转染效率。结果制备出大小均匀、粒径30 nm、稳定性及分散性好的球形硅纳米,硅纳米表面经多聚赖氨酸修饰后作为基因转染载体,能有效地转染pEGFP-C1进入HepG2细胞,转染效率为30%~40%。结论本文成功制备了多聚赖氨酸-硅纳米,该纳米颗粒在体外可作为基因载体,有效转染质粒pEGFP-C1。     

CyclinE基因siRNA真核载体的构建及干扰效果的初步鉴定

根据CyclinE（细胞周期蛋白E）基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向（＋797～＋819）位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.     

壳寡糖纳米载体细胞内递送EGFR脱氧核酶的研究

设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz)，以壳寡糖(COS)为材料，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并研究其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COSEGFR DRz复合体转染效率为88.7%，与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RTPCR结果显示，经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA，使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0~G1期，并且出现凋亡现象，其中COS组的凋亡率为19.3%，大于对照组脂质体的凋亡率13.0%.研究表明，COS较脂质体有相似的转染效率和更低的毒性，是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体.     

能产生多角体的可线性化杆状病毒的构建

【目的】改进用于同源重组研究的制备杆状病毒DNA的方法。【方法】采用PCR方法从BmNPV中扩增出多角体基因,并在其两端引入Bsu36 I酶切位点。将此片段克隆入转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞,获得重组病毒。该病毒能形成多角体,便于纯化,同时可以被 Bsu36 I酶切。该重组病毒的多角体纯化后被裂解,并提取病毒DNA。病毒DNA经Bsu36 I酶切后,与含gfp基因的转移质粒共转染家蚕BmN细胞,在荧光显微镜下观察重组病毒的转染效率。【结果】BmNPV多角体基因克隆入转移载体pBacPAK8中后,与线性化的AcPak6及BmPak6 DNA共转染sf细胞及BmN细胞,均能产生大量的多角体。获得的重组病毒DNA经酶切后,进一步与含gfp基因的转移质粒共转染的实验表明,这种改造后的重组病毒仍具有较高的转染重组率。【结论】本实验成功地对用于同源重组的杆状病毒DNA进行了改进,简化了病毒DNA的纯化方法,并且重组效率较高。     

基于西门利克森林病毒复制子的"自杀性"DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性

对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSfV1进行改造，即在SFV非结构蛋白(nSPs)上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子／增强子序列(hCMV IE Pro／Enh)，同时在pS-FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列，获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性，将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游，构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21细胞，转染后12h即可观察到荧光，但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro／Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1；提取转染后48h的细胞基因组DNA，电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder)，而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明：改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作，而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡，为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征,采用问卷调查的形式,就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示,生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚,有着极大的开发空间,指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主,开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用,尤其是要注重媒体的宣传．     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。     

干旱对合丰42不同部位叶片发育的影响

在垄作、密植两种栽培方式的条件下,研究干旱对大豆不同部位叶片发育的影响。结果表明：无论垄作还是密植,干旱严重影响大豆叶片不同部位叶绿素含量、叶面积及周长的大小、不同部位叶长、叶宽及比值、叶片形状因子等。影响整个植株的生长发育,进而影响作物产量。     

参与式农业基地建设行动方案设计

为了编制实用性强的基地建设行动方案,首先,确定参与式发展的主体,搭建一个“决策框架”;其次,针对行动目标,提出不同参与主体,如管理者、农民、消费者等团队与个人的目标及行动内容;最后,工作应向重塑伙伴式合作关系,挖掘农民自我发展潜力,完成三大角色的转换,打造农业基地文化等方向推进。     

切花菊耐热性鉴定方法研究

以8个切花菊品种为材料,通过对离体叶片进行50℃高温胁迫后,采用电导法、电阻抗图谱法测定电导率、电阻,并对大田栽培植株进行田间高温胁迫试验,比较品种间的耐热性。结果表明:电导法测得的50℃直接相对电导率、修正相对电导率和电阻抗图谱法测得的胞外电阻在品种间有明显差异,但与田间高温胁迫法测定的热害指数不完全一致。电导法和电阻抗图谱法都可以作为测定切花菊耐热性的方法,但需要结合田间耐热性观察。     

探究板栗的科学贮藏方法

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏。基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述。