阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究

研究阳离子脂质体在不同细胞中的转染效率及毒性。首先采用DNA延滞实验研究Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂与DNA的结合能力。然后选用绿色荧光蛋白的质粒pGFP-N2作为报告基因模型和转染试剂制成复合物后转染Hela、7721、HT29细胞,比较多种因素对转染的影响。最后使用MTT比色法分析Lipofectamine2000、DOTAP转染试剂对细胞的毒性。随着复合物中转染试剂比例的增加,Lipofectamine2000、DOTAP与DNA结合能力逐渐增强。Lipofectamine2000在Hela细胞转染最高效率约72％;在7721、HT29细胞转染效率较低。DOTAP在3种细胞的转染效率都很低;在转染效率最高时2种转染试剂的细胞存活率均在90％以上。对商品化的转染试剂研究和讨论以期为阳离子类脂非病毒载体的研究提供参考。     

一种DNA疫苗载体-磷酸钙纳米颗粒的基因转染能力评价

[目的]评价磷酸钙纳采颗粒的基因转染能力,确定其是否具有潜在的DNA疫苗佐剂活性.[方法]以柠檬酸钠作为分散荆,通过共沉淀法合成粒径分布狭窄的磷酸钙纳米颗粒.通过细胞毒性试验评价其安全性,并利用荧光显微镜和流式细胞仪对其基因转染能力进行评价.[结果]成功制备了粒径分布狭窄的磷酸钙纳米颗粒,其平均水合粒径和表面电势分别为692.6 nm和-11.1 mV.同时该材料对293T细胞无明显的毒性作用,且可显著提高pEGFP的细胞转染效率.[结论]柠檬酸钠修饰的磷酸钙纳米颗粒安全性好,具有较强的基因转染能力,是一种潜在的DNA疫苗载体或佐剂.     

细胞种类对阳离子脂质体介导基因转染的影响

[目的]为非病毒载体阳离子类脂的研究提供参考。[方法]以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体,通过DNA延滞试验和质粒转染试验,研究Lipofectamine 2000对不同细胞(HeLa cell、B16 cell、MCF-7 cell和SW-480 cell)的转染效率,将其与其他转染试剂Sofast和DOTAP进行比较,并探讨细胞种类对Lipofectamine 2000转染效率的影响。[结果]随着复合物中转染试剂比例的增加,DNA延滞作用明显增强。当Lipofectamine 2000与DNA的质量比增至51:时,仅有小部分DNA移出原点。Lipofectamine 2000对SW-480cell的转染效率明显高于其他3种细胞。Lipofectamine 2000对B16细胞株的转染效果要优于Sofast,而Sofast与DOTAP的转染效果相当。[结论]Lipofectamine 2000对多数细胞具有较高的转染效率,并不适合所有类型的细胞。     

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

目的:旨在观察不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰作用。方法:采用体外培养的Vero细胞,选用不同茎部长度串联shRNA表达载体+EGFP表达载体+脂质体转染的方法,将构建好的干扰载体转染Vero细胞,然后使用实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒,实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。结果:转染Vero细胞时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的4.3%、3.0%和6.9%;小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的2.5%、1.3%和5.1%。结论:在细胞和个体水平,不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90%以上),比单一位点产生的沉默效应要强许多,不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。     

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表达载体的构建

采用自行设计的带酶切位点的上下游引物,用ＰＣＲ技术,从大肠杆菌ＴＡＣＣ２３７４３的ＤＮＡ中,获得了含有编码尿嘧啶ＤＮＡ糖苷酶（ＵＮＧ）基因的ＰＣＲ产物,以该ＰＣＲ产物构建了重组克隆质粒ｐＧＥＭ／ＵＮＧ,ＤＮＡ序列分析结果确证其中含有完整的ＵＮＧ基因。利用该重组质粒,进一步构建了重组表面质粒ｐＢＶ／ＵＮＧ。     

阳离子交换树脂固定化乳糖酶的研究

[目的]以阳离子交换树脂为载体,研究黑曲霉来源乳糖酶固定化条件,以期改善乳糖酶性质,使黑曲霉乳糖酶更适于低乳糖乳的连续生产。[方法]以吸附率最高的阳离子交换树脂D151为载体,通过先吸附后交联的方法固定乳糖酶,优化固定化条件。[结果]结果表明,加酶量为50．0U／g（载体）,吸附pH值为4．0,吸附温度是25℃,吸附时间24h,交联剂戊二醛浓度为4％,交联温度是30℃,交联时间是6h,固定化效果最好。获得的固定化酶活力可达11．8U／g（载体）,固定酶回收率为37．2％。[结论]该研究为工业化利用固定化乳糖酶连续生产低乳糖乳提供了技术依据。     

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

一种用于形成1kb阶梯DNA分子量标准载体的构建

构建了2个用于产生DNA分子量标准的载体pTLK3和pTLK5.pTLK3由1.0,2.0,4.0和5.0 kb 4个部分组成,经ApaI完全酶切后再用EcoRI部分酶切,可以得到1.0～8.0 kb以及12.0 kb的条带.pTLK5由3.0,0.5和1.5 kb 3个部分组成,用EcoRI完全酶切将得到3.0,0.5和1.5 kb 3种大小的片段.将pTLK3和pTLK5的酶切产物混合,得到1.0 kb阶梯的DNA分子量标准,其条带分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0 kb的条带.此分子量标准适合0.5～8.0 kb的DNA的分子量测定.适用范围较广.     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

介绍一种改进的用普通高拷贝质粒pUC119来制备细菌人工杂色体（BAC）载体基本功能基因序列的新方法及其在构建分子克隆化病毒中的应用,该方法可使BAC载体基本功能基因序列的制备更为简易、高效。     

通过CRISPR/Cas系统构建miR-17-92基因簇双切载体

通过CRISPR/Cas系统来构建miR-17-92基因簇的双切载体,研究结果表明:在miR-17-92基因簇的序列上找到了2个PAM(TGG和GGG)位点,从而得到了2个原间隔序列,设计合成基因簇双链crRNA;合成该片段并将其插入到p X260载体,使得在同一个载体上虽然只有一个g-RNA,但能够同时切割两个不同的靶位点;将该载体转染NIH3T3细胞验证切割效率,PCR结果和测序结果显示,所构建的CRISPR系统可以对基因片段进行有效切割。     

聚赖氨酸接枝淀粉共聚物的制备及其作为基因载体的研究

以还原胺化反应制得PLL-S共聚物,并通过红外光谱以及核磁共振对其进行了结构表征,采用凝胶渗透色谱法检测了PLL-S的相对分子质量,激光粒度分析仪检测了其电位,琼脂糖凝胶电泳法研究了其结合DNA的能力及抗DNaseⅠ的能力,MTT法分析了PLL修饰前后的细胞毒性,并研究了其在293T细胞中转染质粒DNA的能力。结果表明：制备的PLL-S共聚物接枝率为2.8%,数均相对分子质量为60629,电位为23.7mV,达到细胞毒性评价等级0级和1级,材料是合格的,可结合DNA且能保护DNA免受DNaseⅠ的破坏,在293T细胞中的转染效率达到了（48±3.2）%。经对PLL-S的性能分析可以判断：该共聚物可作为基因载体在生物医学方面予以应用。     

水-甘油基离子型磁性液体的合成及其磁化性质

利用二次反应法得到γ-Fe2O3纳米微粒并合成水基和水-甘油基的磁性液体.用透射电子显微镜(TEM)和振动样品磁强计(VSM)对γ-Fe2O3纳米微粒的形态、大小和磁化强度以及磁性液体的磁化性质进行了表征.结果表明体积分数相同的γ-Fe2O3磁性液体,由于基液的不同其饱和磁化强度也不同,水基磁性液体的饱和磁化强度比甘油基磁性液体的大.在这3种不同基液的磁性液体中,磁化性质的场致团聚效应是相同的.     

以LacZ为报告基因探讨促进基因表达及基因免疫应答物质的筛选

应用分子生物学技术构建了LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,并对多种促进基因表达的物质进行了筛选。应用筛选的促进基因表达物质对pcDST基因疫苗的免疫增强效果进行了观察。结果 :构建的LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,肌注后 1天就有表达 ,到第 7天达到高峰。通过对多种促进基因表达的物质进行筛选证明 ,4.5 %斯苯、1 %甘油、2 5 %蔗糖有明显促进基因的表达作用。 4.5 %斯苯、1 %甘油能促进pcDST猪瘟基因疫苗的免疫效果。表明 :4.5 %斯苯、1 %甘油可做为基因疫苗的免疫佐剂使用     

溶胶凝胶法铁基载氧体的制备与反应性能研究

采用以金属醇盐和无机盐为前驱物的两种溶胶凝胶法,以Al2O3为惰性载体,制备了Fe2O3质量分数为70%的载氧体Fe2O3/Al2O3。X射线衍射分析(XRD)表明,载氧体主要成分为Fe2O3和Al2O3。X射线荧光光谱(XRF)证明,样品中Fe2O3/Al2O3含量与设计值接近;利用不同升温速率的程序升温还原(TPR-H2)测试发现,与商业氧化铁相比,溶胶凝胶法制备的载氧体反应峰向高温区移动,说明惰性载体Al2O3对反应活性的提高作用有限。利用同步热重分析仪(TGA)对载氧体进行循环周期测试,合成的载氧体较商业载氧体具有较高的传氧能力和还原反应速率,并且在循环周期内保持了良好的反应性能。说明惰性组分Al2O3通过优化载氧体物理结构,提高了反应过程热效应的稳定性,进一步加强了Fe2O3晶格氧持续、高效的反应活性。     

eNOS基因转染对大鼠颈总动脉损伤后再狭窄程度的影响

为了研究eNOS基因转染对大鼠颈总动脉损伤后再狭窄程度的影响,以2F导管制作球囊损伤的大鼠颈总动脉内膜剥脱模型。用重组真核表达载体pcDNA3.1-eNOS经Fugene6介导体内转染大鼠的损伤后血管平滑肌细胞,2w、1m、2m后处死大鼠,取出大鼠的左侧颈总动脉及对侧正常的颈总动脉,分别应用HE染色和Verhoeff铁苏木精染色,观察血管再狭窄的程度,结果发现:体内eNOS转染组的血管内膜增生明显减弱,再狭窄程度显著低于体内空白对照组和空载pcDNA3.1(-)转染组(P<0.01)。而后二者之间无显著差异(P>0.05)。