水稻幼胚和悬浮细胞系遗传转化效果比较

对中花15的幼胚和悬浮细胞的遗传转化研究表明:它们对潮霉素的筛选压有所不同,幼胚愈伤为50 mg/L,悬浮细胞的耐受压为30 mg/L;采用农杆菌介导法将目的基因gus分别转入这2种不同培养来源的愈伤组织中,通过PCR检测,从91株T0代再生植株中筛选出26株转基因植株,且筛选后得到的抗性愈伤率和绿苗分化率也有差异,其中幼胚来源的分别为40.87%和1.80%,悬浮细胞的分别为30.4%和1.5%,这可能与悬浮细胞后期培养时间较长导致细胞的活力有所降低有关。     

水稻幼胚和悬浮细胞系遗传转化效果比较

对中花15的幼胚和悬浮细胞的遗传转化研究表明：它们对潮霉素的筛选压有所不同,幼胚愈伤为50mg／L,悬浮细胞的耐受压为30mg/L;采用农杆菌介导法将目的基因gus分别转入这2种不同培养来源的愈伤组织中,通过PCR检测,从91株Tn代再生植株中筛选出26株转基因植株,且筛选后得到的抗性愈伤率和绿苗分化率也有差异,其中幼胚来源的分别为40．87％和1．80％,悬浮细胞的分别为30．4％和1．5％,这可能与悬浮细胞后期培养时间较长导致细胞的活力有所降低有关。     

小细胞团为受体的根癌农杆菌介导的非洲菊基因转化体系

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,通过匀浆将其切割成小细胞团,再利用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的GUS基因转化。标记基因GUS的转化及转化愈伤组织的X-Gluc染色证明了该方法可以高频率地（〉80％）获得转化愈伤组织;通过对转化愈伤组织的再生培养,获得了8株X-Gluc染色阳性植株;转化植株的PCR检测和Southern分子杂交检测进一步表明,目的基因已整合入非洲菊基因组中.     

根癌农杆菌介导反义蜡质基因获得水稻植株研究初报

采用根癌农杆菌介导法,将水稻反义蜡质基因导入寒地 4 个水稻品种(系)成熟胚的愈伤组织。这些愈伤组织经连续2 次 25~50 mg/L潮霉素抗性筛选,获得抗性愈伤组织的转化频率为12.15%~25.95%,经分化培养,不同品种的绿苗转化频率分别为 2.49%~4.43%。分化成苗的植株经GUS检测,80%以上的植株叶片呈阳性反应,显示兰色。经 PCR检测,也能扩增出外源基因相应的DNA片断,证明外源基因已整合到转基因植株中。     

根癌农杆菌介导反义蜡质基因的水稻遗传转化

通过根癌农杆菌介导法.将水稻反义蜡质基因导入6个水稻品种(系)幼胚的愈伤组织.这些愈伤组织经连续两次25～50mg/L潮霉素抗性筛选,获得抗性愈伤组织的转化频率为30.75%～59.09%,经分化培养,不同品种的绿苗转化频率分别为3.85%～8.97%.分化成苗的植株经GUS检测,80%以上的植株叶片呈阳性反应,显示蓝色.部分呈阴性反应的植株经PCR检测,也能扩增出外源基因相应的DNA片断,结果证明外源基因已整合到转基因植株中.     

柑橘转基因胚性愈伤组织的筛选与再生

转化子的高效筛选与再生是获得转基因植株的关键。为快速有效地筛选出转化子,并尽可能在较短时间内获得纯合的转基因植株,开展了柑橘胚性愈伤组织的转化研究。以椪柑、冰糖橙、默科特橘橙等胚性愈伤组织为外植体,采用根癌农杆菌介导法进行转化试验,根据愈伤组织再生过程中不同发育阶段的组织对抗生素的敏感程度及在不同筛选压下抗性组织的生长情况,提出了＂5步筛选再生法＂,获得了大量的再生细胞系,并经GUS检测证实为转化子。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

小细胞团为受体的根癌农杆菌介导的非洲菊基因转化体系

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,通过匀浆将其切割成小细胞团,再利用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的GUS基因转化.标记基因GUS的转化及转化愈伤组织的X-Gluc染色证明了该方法可以高频率地(＞80%)获得转化愈伤组织;通过对转化愈伤组织的再生培养,获得了8株X-Gluc染色阳性植株;转化植株的PCR检测和Southern分子杂交检测进一步表明,目的基因已整合入非洲菊基因组中.     

农杆菌介导的旱稻遗传转化主要影响因素

以旱稻品种鲲旱1号为材料,对农杆菌介导的遗传转化中愈伤组织的诱导、筛选、分化等的影响因素进行了研究。将PPA抗虫基因和bar抗性基因成功导入旱稻愈伤组织,经过筛选和分化最终获得了抗性植株。结果表明,改良的NB培养基适合于旱稻愈伤组织的诱导;当农杆菌浓度在OD600 nm为0.2~0.3,侵染时间为20 min时,转化效果最好;用40 mg/L的PPT筛选30 d后,可以获得抗性愈伤组织;将已筛选的抗性愈伤组织在预分化培养基上培养5~7 d能有效提高分化率。     

农杆菌介导的AtMYB118基因转化橡胶树易碎胚性愈伤组织体系优化

[目的]采用正交设计L25(56)优化农杆菌介导的AtMYB118基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织的遗传转化体系,为橡胶树品种遗传改良提供参考.[方法]以75.0 mg/L卡那霉素筛选经过转化的愈伤组织;采用GUS瞬时表达检测方法评价6个因素即预培养时间、农杆菌菌液浓度(OD600)、乙酰丁香酮(AS)浓度、侵染时间、共培养温度和共培养时间对遗传转化的影响.[结果]6个因素显著影响橡胶树长期培养的易碎胚性愈伤组织的转化频率,易碎胚性愈伤组织遗传转化优化条件为:预培养0d,菌液OD600为0.7,侵染时间7 min,共培养时间5d,AS 200 μmol/L,共培养温度25℃.在此优化条件下可获得最高转化频率.经过4~6个月的筛选,获得17个GUS染色阳性的易碎愈伤组织系.经PCR和反转录PCR分析转化愈伤组织,进一步证实uidA、nptⅡ、AtMYB118基因已被整合到愈伤组织基因组中并表达.培养获得1539个胚状体,其中164个为转基因胚状体,转化频率为10.6%;最终获得4株转AtMYB118基因植株.[结论]优化获得可行有效的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化体系,可为其品种遗传改良提供技术支持.     

胡萝卜悬浮细胞系及高效再生系统的建立

以胡萝卜块根为材料诱导愈伤组织,并建立悬浮细胞系,然后将悬浮细胞和愈伤组织分别转入分化培养基进行分化培养。结果表明,胡萝卜块根形成层愈伤组织诱导率为100%,最佳激素种类和用量为2,4!D0.1mg/L;根据外观可将愈伤组织大致分为4种类型,I型是直接建立悬浮细胞系的良好来源,Ⅲ型经继代培养后可用于悬浮细胞系的建立;静止法是胡萝卜悬浮细胞系简单而有效的继代方法;胡萝卜愈伤组织分化的最佳培养基是MS或B5基本培养基,MS培养基上的再生苗可直接生根,而B5培养基上的再生苗在原培养基上很难生根,需要转移到MS培养基上才能生根。     

苹果组培苗离体叶片诱导不定芽分化

以福早红、鲁加3号和鲁加6号3个苹果品种的组培苗叶片为试材,研究了植物生长调节剂、基因型、暗培养、AgNO3对苹果叶片不定芽分化的影响.结果表明:福早红、鲁加3号和鲁加6号3个苹果品种的组培苗叶片分化最佳培养基分别为MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.20 mg/L,MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.10 mg/L,MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.05 mg/L;基因型是决定苹果组培苗叶片分化的重要因素,3个苹果品种叶片分化不定芽的能力从大到小依次是福早红、鲁加6号、鲁加3号;暗培养可以明显促进苹果叶片进行脱分化,提高叶片的分化率,苹果叶片暗培养处理的最佳时间为15 d;AgNO3抑制苹果叶片愈伤组织的形成,不能促进其叶片不定芽的形成.     

苹果品种试管苗叶片再生不定芽

建立了富士和乔纳苹果的试管苗叶片再生系统。在适宜条件下，乔纳金叶片再生频率达１００％，富士叶片则达９０％以上。叶片接种后，立即进行一段时间的暗培养是必需的。培养基附加水解乳蛋白（ＬＨ）２５０ｍｇ／Ｌ，可以显著提高富士叶片再生频率，附加新霉素７５ｍｇ／Ｌ，可以完全抑制芽再生和愈伤组织形成。     

菊花叶片离体高效再生体系的建立

本文报道了以菊花叶片为外植体，诱导植株再生，建立高效植株再生体系。获得诱导愈伤组织、芽和根的最佳培养基。在有6-BA、NAA的MS培养基上获得较高的愈伤组织诱导率，在有2，4-D的培养基上其愈伤组织诱导率很低。带有愈伤组织的外植体转移到有6-BA、NAA的MS培养基上催化芽的产生，并筛选出能直接诱导芽再生的培养基(MS 6-BA(3mg／L) NAA(1mg／L))。AgNO3可明显提高芽的再生率。茎段在1／2MS和有IBA或NAA的1／2MS培养基上诱导生根。生根的小苗在温室里生长良好。     

苹果叶片不定芽再生过程的差异表达基因鉴定与分析

【目的】筛选分析‘GL-3’苹果叶片不定芽再生过程中的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,进一步解析苹果叶片不定芽再生的潜在分子机制,为提高苹果的遗传转化效率提供理论参考。【方法】‘GL-3’苹果继代组培苗叶片外植体接种在再生培养基上,分别于0、3、7、14和21 d后取样并提取RNA,构建mRNA文库后采用Illumina Nova seq平台进行测序。筛选出各时间点的DEGs,根据GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释结果以及官方分类,使用R软件中的phyper函数对筛选到的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用BLAST软件进行基因比对注释;重点分析植物再生相关的激素、酶、转录因子、多胺等DEGs;采用qRT-PCR对DEGs进行定量验证。【结果】再生培养基上培养3、7、14和21 d的苹果叶片外植体与对照组相比,分别筛选到5 250、4 937、6 852、6 493个DEGs,4个时间点共有的DEGs有3 027个。DEGs的GO功能富集显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要与氧化还原过程、细胞外围、蛋白激酶活性和有机环化合物结合等功能有关;下调表达的DEGs主要与单细胞代谢过程、钙离子结合、光合膜和类囊体部分等功能有关。DEGs的KEGG通路富集分析显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要富集在磷酸戊糖途径、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用和内质网蛋白质加工等途径中;下调表达的DEGs主要富集在α-亚麻酸代谢、苯丙烷生物合成、碳代谢和光合作用等途径中。对与植物离体叶片再生相关的激素、酶、转录因子和多胺等相关DEGs的表达模式进行分析发现,这些DEGs大部分呈上调表达趋势。经qRT-PCR验证后,所检测基因的表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】通过对苹果叶片不定芽再生过程中不同时间点的基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量与苹果叶片不定芽再生相关的基因,研究结果为深入探讨苹果离体叶片再生机理提供了理论依据。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10的克隆及功能鉴定

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果（Malus×domestica‘Royal Gala’）为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统进化树。利用qRT-PCR检测MdPAP10在苹果不同组织的表达情况和对低磷胁迫的响应特性。将MdPAP10连接到植物过表达载体pBI121,转化LBA4404农杆菌,用于侵染苹果愈伤组织。通过在抗性培养基上筛选和PCR鉴定,获得MdPAP10转基因愈伤组织。在低磷培养基上培养MdPAP10转基因愈伤组织检测其酸性磷酸酶积累情况以及对低磷胁迫的耐受性和磷含量。最后利用qRT-PCR检测MdPAP10转基因愈伤组织中磷相关基因的表达量。【结果】克隆获得苹果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10（基因序列号：MDP0000272096）,开放阅读框为1 332 bp,编码含有443个氨基酸的蛋白。蛋白质结构分析显示,MdPAP10包含一个信号肽和一个磷酸酶结构域。基因结构分析显示,MdPAP10含有5个外显子和4个内含子。进化树分析显示,苹果MdPAP10与白梨PbPAP10同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,MdPAP10在根、茎、叶、花、果中均有表达,并且在根中的表达量最高。MdPAP10对低磷条件有明显响应,在根中表达量逐渐升高,在6 h达到最大后逐渐下降;在叶中的表达量始终低于对照组。MdPAP10转基因愈伤组织在低磷条件下能够明显促进酸性磷酸酶的分泌。在低磷条件下培养转基因愈伤组织20 d发现过表达MdPAP10提高了愈伤组织对低磷胁迫的耐受性,并且提高了对磷的吸收。qRT-PCR结果显示,过表达MdPAP10能够明显促进苹果磷相关基因的表达。【结论】MdPAP10能够对低磷胁迫有明显响应,在低磷条件下能够促进磷吸收和酸性磷酸酶的分泌。MdPAP10在响应低磷胁迫过程中发挥着重要的正调控作用。     

柱型苹果鲁加16号叶片再生研究

[目的]建立柱型苹果鲁加16号的最佳叶片再生体系。[方法]以柱型苹果鲁加16号的3年生试管苗叶片为外植体,研究基本培养基、激素种类及浓度配比、暗培养、接种方式及外植体苗龄对鲁加16号叶片再生的影响。[结果]3种培养基中以MS培养基为最好,鲁加16号叶片在MS培养基上的再生频率和平均生芽数分别为62.7%和3.3个,明显高于B5(40.2%和2.1个)和1/2MS(50.4%和2.6个)培养基。该叶片再生芽数与激素的浓度及其配比密切相关。该叶片最适宜的培养基是:MS+6-BA4.0 mg/L+NAA0.10 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L。叶片的正反面接种方式对叶片再生没有显著影响。暗培养对叶片再生不是必需的,但暗培养2周左右能明显提高叶片的再生能力。[结论]选择苗龄25～30 d、叶色嫩绿、长势较强的叶片作为外植体,可以显著提高苹果离体叶片的再生频率。     

苹果MdcyMDH过量表达对光合、激素和生长的影响

【目的】获得过量表达苹果细胞质苹果酸脱氢酶基因（MdcyMDH）的苹果植株,评价其过量表达对转基因株系生长的影响,并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理,为进一步揭示该基因调控生长发育的机制奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆MdcyMDH编码区,连接植物表达载体pBI121,转化农杆菌LBA4404;利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片,通过叶片再生的方法获得MdcyMDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料,提取基因组DNA,利用来自35S启动子和转化基因序列的引物,通过PCR初步筛选转基因株系;然后,提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA,分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测MdcyMDH表达量,来确定MdcyMDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料,进行生根处理,30 d后测定MdcyMDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料,测定叶片光合参数和叶绿素含量的变化;以组培苗为材料,利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料,PCR初步筛选获得了3个转基因株系,即Line 2、Line 3和Line 4;半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中MdcyMDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍,因此确定以上两个株系为MdcyMDH过表达株系。此外,MdcyMDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因（MdchMDH）表达量。组培苗生根培养30 d后,MdcyMDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响,但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量;与野生型相比,MdcyMDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。MdcyMDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率,Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%;转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高,但其胞间CO₂浓度显著降低;MdcyMDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量,与对照相比,Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明,MdcyMDH过量表达显著抑制了ABA水平,其含量约为对照的1/2。【结论】MdcyMDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长,尤其是促进了生根。     

类番茄茄茎段原生质体再生成株的研究

利用类番茄茄 (SolamumlycopersicoidesDun .)无菌苗幼嫩茎段酶解获得大量原生质体 (个 ) (2× 10 6/g) ,将原生质体密度稀释至 1× 10 5/mL于HMA培养基中培养 ,则 10d左右出现小细胞团 ,38～ 40d形成肉眼可见的小愈伤组织 (1～ 1.5mm) ,转移至MC增殖培养基 2周后 ,再转移到 15 #分化培养基诱导出芽 ,切取芽体转入5 0P培养基诱发根原基 ,再转入 5 0 #发根培养基形成发达根系 ,成为再生植株 ,整个再生周期 80～ 90d ,再生植株移植至土壤中均能正常生长、开花