野生茄托鲁巴姆蛋白酶抑制剂基因StPI1的克隆与特征分析

以野生茄托鲁巴姆为材料,在利用SSH文库获得基因片段的基础上,采用RACE方法克隆了1个蛋白酶抑制剂Ⅱ型基因的全长cDNA序列,命名为StPI1。StPI1 cDNA序列全长790bp,含有29bp的5′-UTR和201bp的3′-UTR,编码包含202个氨基酸的前体蛋白。StPI1前体蛋白N末端1~27位为信号肽,成熟蛋白含有3个保守的蛋白酶抑制剂Ⅱ结构域。预测StPI1蛋白含有1个磷酸化位点、1个糖基化位点和3个N端酰基化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StPI1在托鲁巴姆根中呈上调表达。     

小麦白粉菌产孢相关基因 BgtFTT1的序列特征和基因表达分析

旨在揭示小麦白粉菌 BgtFTT1基因的序列特征及其在白粉菌分生孢子形成过程中的表达规律,为解析14-3-3蛋白在小麦白粉菌无性生殖调控中的作用奠定理论基础。通过基于转录组数据的序列分析和PCR扩增技术克隆 BgtFTT1基因的cDNA序列,采用生物信息学和分子生物学方法分析 BgtFTT1的序列特征和分子结构,监测该基因在白粉菌产孢过程中的表达动态。结果表明, BgtFTT1完整的开放阅读框长度为891 bp,编码1个含有296个氨基酸的偏碱性亲水蛋白,预测的分子质量为34.18 ku,属于14-3-3蛋白家族。BgtFTT1含有5个蛋白激酶C磷酸化位点,不含信号肽和跨膜螺旋。BgtFTT1的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,三级结构呈“球状”。BgtFTT1和源自其他白粉菌的同源蛋白在进化上独立于源自兼营腐生真菌的14-3-3蛋白。在21个白粉菌菌株中,BgtFTT1存在2个氨基酸位点的变异。 BgtFTT1基因表达水平在小麦白粉菌足细胞和分生孢子梗形成阶段显著上调。     

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

野生茄子托鲁巴姆StLTPa7的克隆与分析

【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

黄颡鱼硒蛋白基因的克隆与分析

为探讨黄颡鱼硒蛋白selenow2a、selenop2和selenot2基因之间的关系，采用3′/5′ RACE PCR克隆得到3个基因的cDNA全长，分别为891、1 998和1 432 bp，其中ORF长度分别为288、828和600 bp，编码95、275和219个氨基酸。在线工具SECISerach3对3个基因的cDNA序列分析结果显示，它们都含有可以编码硒代半胱氨酸的终止密码子，以及在3′非编码区存在SECIS元件。通过氨基酸序列比对和系统发育树分析，发现selenow2a、selenop2和selenot2基因预测得到的氨基酸序列与斑马鱼（Danio rerio）氨基酸相似性分别为82.24%、66.19%和79.45%，而与斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）的氨基酸相似性分别为94.74%、68.50%和90.95%，在发育树上则显示为树杈相接近。采用实时荧光定量PCR检测3个硒蛋白基因的mRNA在黄颡鱼心脏、肝脏、肌肉、脑、肠、脾脏、精巢和卵巢组织中的表达，结果显示其mRNA表达水平呈现组织特异性。表明3个基因拥有硒蛋白家族的特征，但在组织表达上具有特异性。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

2009-2015年陕西棉花品种抗病性鉴定及分析

通过对陕西省2009-2015年棉花区域试验及生产试验160个陆地棉棉花品种（系）的抗枯黄萎病的鉴定结果分析,未发现对枯萎病和黄萎病均免疫的品种。对枯萎病呈高抗的品种有71个,占测试品种的38.1%;未发现对黄萎病高抗的品种,达到抗性水平的品种有77个,占测试品种的48.1%。从7 a测试结果来看,对枯萎病抗性水平总体呈下降趋势,对黄萎病抗性水平总体呈增强趋势,但未见对黄萎病抗性水平达到高抗及以上的品种。共筛选出7个品种（系）对枯黄萎病表现突出的兼抗性。     

水分散粒剂H14对棉花黄萎病发生及土壤细菌群落的影响

试验设置水分散粒剂(H14)、商业可湿性粉剂(SY)和空白对照(CK)3组处理,在棉花花铃期调查黄萎病发生状况,并通过高通量测序分析不同处理中细菌群落多样性。结果显示同CK处理相比,H14和SY处理中棉花黄萎病发病率分别显著下降42.35%和39.25%,病情指数分别显著下降52.41%和48.78%;大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)相对丰度分别显著下降45.73%和24.47%。3组处理样品测序后共获得517 453个优质序列,基于97%的序列相似度进行聚类分析,获得可操作分类单元(OTUs)24 353个,经鉴定属于细菌的54个门、244个科和571个属。其中变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)为各处理样品的优势菌群。H14、SY处理中Chao1和ACE指数相较于CK处理分别增加16.27%和14.71%、13.84%和12.90%;Shannon和Simpson指数相较于CK处理分别增加2.65%和1.02%、1.38%和0.00%。全部样品丰度前35个属通过聚类分为A、B、C、D 4个类群,其中C和D两个类群是H14处理中优势类群,此类群中的芽孢杆菌属(Bacillus)、芽生球菌属(Blastococcus)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)多为生防菌;斯科曼氏球菌属(Skermanella)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)多为氮循环功能菌;酸杆菌属(Acidibacter)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)多为产铁载体促生菌。施用水分散粒剂H14可以提高棉花根围土壤细菌群落物种丰富度和多样性,增加防治土传病害以及氮铁等营养元素转化的相关菌属丰度,有利于改善土壤生态环境,抑制大丽轮枝菌繁殖,促进棉花健康生长。     

陆地棉GhSAMDC基因家族的全基因组分析

以已报道的SAMDC为探针序列,从异源四倍体陆地棉基因组数据库中筛选获得14个GhSAMDC家族基因。GhSAMDC家族基因的氨基酸多重序列比对发现该家族成员序列相似性约为50%,家族成员均具有GhSAMDC家族特有的保守结构域:酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。染色体定位分析发现14个基因均匀地分布在A和D基因组,A和D上各含7个GhSAMDC成员,无家族成员构成基因簇的现象。转录组测序结果发现 GhSAMDC1、 GhSAMDC7和 GhSAMDC8对黄萎病菌的胁迫有明显的响应,暗示这些在棉花抵御黄萎病菌胁迫过程中发挥一定的作用。试验为进一步研究GhSAMDC家族基因的功能及解析棉花抗黄萎病分子机制奠定了一定基础。     

疣粒野生稻半胱氨酸蛋白酶基因ME085的cDNA全长克隆及序列分析

为了发掘疣粒野生稻抗性基因,从受白叶枯菌诱导的疣粒野生稻叶片抑制差减文库(SSH文库)中选择抗病相关的EST序列,运用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得一个基因全长,命名为ME085。通过生物信息学分析表明该基因全长1 171bp,具有一个750bp的开放阅读框,编码249个氨基酸,其理论等电点为5.76,相对分子质量为27 580.1,存在一个明显的半胱氨酸蛋白酶结构域。推测该基因是一个半胱氨酸蛋白酶基因。     

黄萎病侵染后棉花根部内生真菌群落结构分析

为研究黄萎病菌侵染对棉花根部内生真菌群落结构的影响,采用PCR-DGGE技术分析黄萎病侵染后苗期、蕾期、花期、铃期健康棉株和发病棉株内生真菌群落组成。结果显示,在棉花生长中后期,发病棉株样品中各指数均高于健康棉株,说明黄萎病菌侵染可提高内生真菌群落结构的多样性;在DGGE电泳图谱中,对差异明显的17个条带进行切胶回收、克隆测序,发现有7个条带分布在半知菌亚门,占41.18%,4个条带分布在子囊菌亚门,占23.53%,其他条带分别为fungal endophyt、uncultured fungus、Dothideomycete和Acremonium cellulolyticus。说明:黄萎病菌侵染能明显改变内生真菌群落结构多样性。     

番茄WD40家族SlWDR204调控植株形态建成的功能分析

作物的株高是非常重要的农艺性状,影响农作物的品质和产量.植物中WD40蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用.克隆了番茄SlWDR204基因,利用植物基因工程技术,构建植物过表达载体pBI121-35S::SlWDR204,通过农杆菌介导法获得过表达转基因植株.生物信息学分析表明该蛋白含有典型的WD40蛋白基序.定量RT-PCR分析发现在番茄各器官及果实发育不同时期该基因均有表达.观察发现SlWDR204过表达转基因植株相对于野生型植株,表现出较长的茎秆长度,表明该基因是番茄植株高度的正向调控因子.酵母双杂交文库筛选发现转录因子S1SPL3与S1WDR204具有相互作用,S1WDR204与S1SPL3可能共同调控番茄植株的茎杆发育.该研究增加了对番茄WD40蛋白参与株高调控的认知.     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

Cloning of TaCYP707A 1 Gene that Encodes ABA 8′-Hydroxylase in Common Wheat（Triticum aestivum L.）

The plant hormone abscisic acid （ABA） regulates many important physiological and developmental processes in plants. The objective of this study was to clone the ABA 8′-hydroxylase gene in common wheat. In the present study, we used the eDNA sequence of barley HvCYP707A1 gene （GenBank accession no. AB239299） as a probe for BLAST search against the common wheat （Triticum aestivum L.） EST database in GenBank. All wheat ESTs sharing high similarity with the reference gene were subjected to contig assembly. Primers were designed based on the constructed contigs to clone the wheat CYP707A1 gene, designated as TaCYP707A1. The genomic DNA sequence of TaCYPTO7A1 gene comprised five exons and four introns, with a size of 2225 bp. The corresponding cDNA sequence of TaCYP707A1 was 1737 bp, containing an open reading frame （ORF） of 1431 bp, a 42-bp 5′-untranslated region （UTR） and a 264-bp 3′UTR, with 94.9% of identical sequences to HvCYP707A1 gene （AB239299）. The neighbor joining tree indicated that the deduced amino acid sequences of TaCYP707A1 gene was highly similar to those of barley and rice. The TaCYP707A1 gene was located on chromosome 6BL using a set of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 6BS. These results will be of high importance in understanding of molecular mechanism of ABA catabolism.     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.